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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 루테올린의 항치매 효능을 규명하고자, 베타아밀로이드로 신경소교세포 사멸을 유도한 후 루테올린에 의한 보호효과를 관찰하였고, 항산화기전을 중심으로 작용기전을 규명하고자 하였다. 노인성 치매의 병인에 있어 산화적 조직손상 및 신경소교세포의 활성화가 큰 부분을 차지하고 있으므로, 루테올린의 신경소교세포에 대한 보호효과를 정확히 규명하고 적절히 조절한다면 이는 노인성 치매의 예방 및 조절에 크게 기여할 것으로 사료된다.
- 특히, 발병기전이 복합적인 치매에 대해 단일 표적중심의 합성신약이 치료 효능상의 한계점을 드러내고 있기 때문에, 여러 경로의 표적을 동시에 제어하고 부작용을 경감시킬 수 있는 천연물 유래 항치매 활성물질에 대한 관심이 고조되고 있다. 따라서, 본 연구에서는 천연물질인 임자엽(荏子葉)에 많이 함유된 루테올린의 신경세포 보호 효능과 작용 기전을 규명하고 치매의 예방 및 치료물질로서 가능성을 검토하기 위하여, 신경소교세포인 BV-2 세포를 대상으로 항산화 작용 및 신경세포 사멸 억제에 미치는 루테올린의 효과에 중점을 두고 일련의 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 베타아밀로이드로 유도된 신경독성 및 사멸에 대한 루테올린의 보호기전을 규명하고자, 세포내 축적된 활성산소종의 양을 DCF-DA 형광염료를 사용해 측정하였다. 베타아밀로이드(Aβ25-35, 15 µM)를 처리한 결과 녹색형광의 강도 즉, 세포 내 활성산소종의 축적이 현저히 증가되었으며, 이는 루테올린(1 µM 및 3 µM)을 전처리함으로써 효과적으로 감소되었다(Fig.
- 생체내 항산화방어체계에 미치는 루테올린의 영향을 보다 세밀하게 규명하기 위하여, 항산화방어체계의 대표적인 분자 중의 하나인 세포내 글루타치온(glutathione, GSH) 수준을 측정하였다. 베타아밀로이드(Aβ25-35, 15 µM)를 처리한 결과 세포내 GSH 수준은 대조군에 비해 감소하였으며, 이는 루테올린을 1 µM 및 3 µM의 농도로 전처리함으로써 농도의존적으로 회복되었다(Fig.
대상 데이터
- 마우스 신경소교세포주인 BV-2 세포는 10% FBS 및 penicillin (10,000 IU/ml)-streptomycin (10,000 g/ml) 항생제를 포함하는 DMEM 배양액에서, 5% CO2와 37℃ 조건으로 유지 배양하였다. 배지는 이틀에 한 번씩 갈아 주었으며, 각각의 실험 규모에 맞게 세포를 도포하여 실험에 사용하였다.
- 베타아밀로이드(β-Amyloid25-35, Aβ25-35)는 American peptide (Sunnyvale, CA, USA)에서, 루테올린은 LKT Laboratories, Inc. (St.
- Paul, MN, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 세포배양에 사용된 Dulbecco’s modified Eagel’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및 항생제(penicillin/streptomycin)는 Gibco (Grand Island, NY, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 형광 염색시약 tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) 및 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA)는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)의 제품을 사용하였고, MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 및 일반 시약은 Sigma-Aldrich (St.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균 ± 표준편차로 표기하였다. 그룹간의 통계적 유의성은 ANOVA로 검정한 후, 사후분석으로 Turkey's test를 실시하여 p < 0.05 일 때 유의성이 있다고 판정하였다.
- 모든 실험결과는 평균 ± 표준편차로 표기하였다. 그룹간의 통계적 유의성은 ANOVA로 검정한 후, 사후분석으로 Turkey's test를 실시하여 p < 0.
이론/모형
- BV-2 세포에서 베타아밀로이드(Aβ25-35, 15 µM)를 처리하여 신경독성을 유도하고 이에 대한 루테올린(LUT)의 보호효과를 규명하기 위하여 상대적 세포생존율을 MTT assay로 측정하였다. 우선 다양한 농도(1, 3, 10, 30 µM)의 루테올린을 단독으로 24시간 동안 처리했을 때, 10 µM 이상의 농도에서는 루테올린 자체의 세포독성이 발현됨을 관찰하였다.
- 루테올린에 의해 억제되는 세포사멸의 형태를 규명하기 위하여 apoptosis를 측정하는 대표적인 지표중의 하나인 DNA fragmentation을 TUNEL 염색법을 통해 확인하였다. 베타아밀로이드(Aβ25-35, 15 µM)를 24시간 처리한 결과 TUNEL-양성인 세포의 수가 유의적으로 증가했으며, 이는 Aβ25-35에 의한 세포사멸의 형태가 apoptosis임을 시사한다.
- 베타아밀로이드가 유도하는 세포사멸 형태를 측정하기 위해 apoptosis의 특징적인 지표인 DNA 절편화(fragmentation)를 TUNEL 염색 키트(Roche, Germany)를 이용하여 측정하였다. 시약 처리가 끝난 세포에 100 µl의 10% neutral buffered formalin (Sigma-Aldrich)을 가하여 1시간 동안 고정시킨 다음 인산완충용액(phosphate-buffered saline, PBS)으로 3회 세척하였다.
- 베타아밀로이드로 인한 세포독성에 대한 루테올린의 보호효과를 관찰하고자 MTT 환원법을 이용하였다. BV-2 세포를 48-well plate에 8×104 개/well의 밀도로 깐 다음 24시간 동안 안정화 시켰다.
- 세포내에 축적된 활성산소종을 정량하기 위하여 DCF-DA 염색시약을 사용하였다. BV-2 세포를 5x104개/well의 밀도로 4 well-chamber slide에 분주한 뒤, 베타아밀로이드와 루테올린을 6시간 동안 처리하였다.
성능/효과
- 1. 신경소교세포 모델인 BV-2 세포에서 루테올린은 베타아밀로이드로 인한 신경세포 독성 및 사멸을 효과적으로 보호하였으며, 이는 붕괴된 미토콘드리아 막전압 회복, 변동된 Bcl-2/Bax 발현 정상화, JNK 및 caspase-3 활성화 억제에 의해 매개되는 것으로 사료된다.
- 2. 더 나아가, 루테올린은 베타아밀로이드로 유도된 신경독성 및 사멸 과정에서 활성산소종의 생성을 감소시키고 지질과산화 및 GSH 고갈로 대표되는 산화적 손상을 억제하였다.
- 3. 루테올린은 GCL 및 SOD를 비롯한 세포 내 항산화방어체계의 기능 강화를 통해 베타아밀로이드로 유도된 산화적 손상 및 사멸로부터 신경소교세포를 보호할 수 있는 저항성을 제공하였고, 이는 천연 치매 예방 및 치료 물질로서 루테올린의 활용 가능성을 시사한다.
- 5A). 따라서 베타아밀로이드로 유도된 신경독성 및 사멸에 대한 루테올린의 보호효과에는 신경세포 내 활성산소종의 생성 감소 및 지질과산화 억제가 관련됨을 알 수 있다.
- 본 연구에서 루테올린은 베타아밀로이드로 인한 세포내 활성산소종의 축적을 감소시켰으며, 이로 인한 지질 과산화의 증가 및 내인성 항산화 물질인 GSH 고갈을 효과적으로 억제하였다. 특히 뇌는 에너지 대사가 활발하고, 전이금속이 충분히 존재하며, 지질이 풍부하기 때문에 지질이 산화적 손상을 받기 쉬우며, 지질 과산화 연쇄반응을 통해 다량의 지질과산화물이 생성될 수 있다.
- 본 연구에서 베타아밀로이드를 BV-2 세포에 처리한 경우 세포독성 및 사멸이 유발되었으며, 이는 루테올린을 전처리 함으로써 농도 의존적으로 효과적으로 보호되었다. 특히 루테올린은 BV-2 세포에서 베타아밀로이드로 인한 apoptosis 과정 즉, apoptosis 관련 상위 인산화 효소인 JNK의 활성화, apoptosis 매개 단백질인 Bax의 발현 증가, apoptosis 억제 단백질인 Bcl-2의 발현 감소, 이후 미토콘드리아 막전압 손상, caspase-3 활성화 등 일련의 신호전달 과정을 억제함으로써 궁극적으로 DNA 절편화를 억제함으로써 세포를 보호하였다.
- 본 연구결과 루테올린은 두 가지 형태의 SOD 효소의 단백질 발현을 모두 증가시켰다. 이상의 결과들은 루테올린이 내인성 항산화 물질인 GSH 및 이를 합성하는 항산화효소 GCL, SOD 등을 포함하는 세포내 항산화 방어체계의 기능 강화를 통해 베타아밀로이드로 유도된 산화적 신경사멸로부터 신경세포를 보호할 수 있는 저항성을 제공함을 시사한다.
- 특히 루테올린은 BV-2 세포에서 베타아밀로이드로 인한 apoptosis 과정 즉, apoptosis 관련 상위 인산화 효소인 JNK의 활성화, apoptosis 매개 단백질인 Bax의 발현 증가, apoptosis 억제 단백질인 Bcl-2의 발현 감소, 이후 미토콘드리아 막전압 손상, caspase-3 활성화 등 일련의 신호전달 과정을 억제함으로써 궁극적으로 DNA 절편화를 억제함으로써 세포를 보호하였다. 이상의 결과들을 종합하면, BV-2 세포에서 베타아밀로이드 유도된 신경독성 및 사멸에 대한 루테올린의 보호효과는 붕괴된 미토콘드리아의 막전압 회복, 변동된 Bcl-2/Bax 발현 정상화, JNK 및 caspase-3의 활성화 억제에 의해 매개되는 것으로 사료된다.
후속연구
- 루테올린이 세포내 항산화 방어체계를 강화시키는 분자생물학적 작용 기전에 대해서는 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 이와 관련해 다양한 신경세포 모델에서 항산화 보호효능을 연구한 결과들을 검토해보면 내인성 GSH, 항산화효소 외에, NF-E2-related factor 2 (Nrf2)나 NF-κB 같은 산화-환원 반응에 민감하게 작용하는 전사인자들도 루테올린의 신경보호작용을 매개할 것으로 예측된다21,23).
- 본 연구에서는 임자엽의 주요 활성성분 중의 하나인 루테올린을 소재로 신경소교세포에서의 효능 및 기전을 일차적으로 제시하였지만, 향후 연구에서는 다양한 산지 및 추출법으로 얻어진 임자엽 조추출물과의 효능 비교 및 루테올린 함량과의 연관성 규명, 그 외 루테올린을 함유하고 있는 금은화(金銀花), 인동등(忍冬藤) 추출물과의 비교연구, 이들 약제를 포함한 방제와의 비교연구 등이 단계적으로 수행되어져야 할 것이다.
- 즉, ICR 마우스 모델에서 OK-432로 인한 혈청내 TNF-α 생성 증가와 oxasoline 또는 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)로 유도된 귀부종의 경우 rosmarinic acid와 caffeic acid에 의해서는 변화가 없었지만 루테올린에 의해 현저히 감소되었다. 특히, 루테올린은 다른 활성물질들과 상승작용(synergistic effect)이 다수 보고되어 있으므로, 루테올린을 활성성분으로 함유하는 조추출물의 경우 더 높은 항치매 활성을 기대할 수 있을 것이다.
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