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문제 정의
- 본 연구팀은 이전에 keratinase를 생산하여 우모를 효율적으로 분해할 수 있는 Pseudomonas geniculata를 최초로 분리하여 기질 특이성 등을 보고한 바 있다(Go 등, 2012). 따라서 본 연구에서는 이 균주에 의한 keratinase 생산 최적조건을 조사하고, 동시에 실험균주의 식물성장 촉진 활성을 검토함으로써 난분해성 우모의 생물학적 처리 및 분해산물의 생물비료로써의 응용을 위한 기초자료를 획득하고자 하였다.
- 본 연구에서는 우모를 분해할 수 있는 것으로 보고된 P. geniculata의 keratinase 생산 최적조건을 OVT 방법을 통하여 조사하였다. 확립된 keratinase 생산 최적 배지 조성은 glucose 0.
제안 방법
- Keratinase 생산조건을 최적화하기 위해 사용한 방법은 OVT 방법이며, 탄소원, 질소원, 무기염, pH, 온도 및 진탕속도의 순서로 배지 및 배양조건을 변화시키면서 keratinase 활성을 측정하였다.
- 탄소원에 따른 kertatinase 활성을 조사한 결과는 Table 1에서 보는 바와 같다. 각 탄소원을 0.1%씩 첨가했을 때 glucose, sorbitol 그리고 glycerol이 다른 탄소원에 비해 높은 keratinase 생산(6.9～7.9 U/ml)을 유도하였다. 탄소원을 첨가하지 않았을 경우에도 4.
- 각종 탄소원(glucose, fructose, sucrose, maltose, lactose, galactose, glycerol, mannitol, soluble starch) 0.1%를 배지에 첨가하여 배양한 후, 최저 탄소원을 선정하였다. 최적 탄소원이 첨가된 배지에 각종 질소원(beef extract, hammersten casein, casamino acid, casein, corn steep liquor, gelatin, malt extract, polypeptone, skim milk, tryptone, yeast extract, soytone, urea, (NH4)2SO4, NH4Cl, NH4NO3, NH4H2PO4, (NH4)2HPO4, KNO3, NaNO2, NaNO3) 0.
- 배지의 pH (4～11), 배양온도(20～45℃) 및 진탕속도(100～250 rpm)가 keratinase 생산에 미치는 영향을 조사하였으며, 기본배지와 최적배지에서 배양시간에 따른 keratinase 활성의 변화를 측정하였다.
- 대표적인 식물성장 호르몬인 indoleacetic acid(IAA)의 생성능은 Tang과 Bonner의 방법(1947)에 의하여 조사하였다. 실험균주의 배양 상등액을 Salkowsky reagent와 혼합하여 30분간 반응시킨 후, 반응액의 색상이 분홍색으로 전환된 것을 IAA 생성능이 있는 것으로 결정하였다. 실험균주의 암모니아 생성능(ammonification)은 Dey 등(2004)의 방법에 의하여, siderophore 생성능은 Chrome azurol S assay (Schwyn과 Neilands, 1987)에 의하여, 식물병원성 진균 세포성분 분해효소(amylase, cellulase, chitinase, lipase, pectinase, protease)의 활성은 standard method (Gerhardt 등, 1981)에 의하여 정성 분석하였다.
- 실험균주의 생육도는 배양액 내에 잔존하는 미분해 우모를 Whatman no.1 여과지를 이용하여 제거한 후, 여액의 흡광도를 660 nm에서 측정함으로써 확인하였다. 배양액의 단백질 농도는 Bradford법(Bradford, 1976)을 이용하여 측정하였으며, 표준물질로는 bovine serum albumin을 사용하였다.
- 1%를 배지에 첨가하여 배양한 후, 최저 탄소원을 선정하였다. 최적 탄소원이 첨가된 배지에 각종 질소원(beef extract, hammersten casein, casamino acid, casein, corn steep liquor, gelatin, malt extract, polypeptone, skim milk, tryptone, yeast extract, soytone, urea, (NH4)2SO4, NH4Cl, NH4NO3, NH4H2PO4, (NH4)2HPO4, KNO3, NaNO2, NaNO3) 0.01%를 첨가하여 배양한 후, 최적 질소원을 선정하였다. 이후, K2HPO4, KH2PO4, NaCl, MgSO4·H2O, MgCl2·H2O 첨가 실험도 순차적으로 수행하였다.
이론/모형
- 대표적인 식물성장 호르몬인 indoleacetic acid(IAA)의 생성능은 Tang과 Bonner의 방법(1947)에 의하여 조사하였다. 실험균주의 배양 상등액을 Salkowsky reagent와 혼합하여 30분간 반응시킨 후, 반응액의 색상이 분홍색으로 전환된 것을 IAA 생성능이 있는 것으로 결정하였다.
- 1 여과지를 이용하여 제거한 후, 여액의 흡광도를 660 nm에서 측정함으로써 확인하였다. 배양액의 단백질 농도는 Bradford법(Bradford, 1976)을 이용하여 측정하였으며, 표준물질로는 bovine serum albumin을 사용하였다. 우모의 분해율은 우모의 건조무게 감소량을 측정한 후, % 백분율로 나타내었다.
- 실험균주의 배양 상등액을 Salkowsky reagent와 혼합하여 30분간 반응시킨 후, 반응액의 색상이 분홍색으로 전환된 것을 IAA 생성능이 있는 것으로 결정하였다. 실험균주의 암모니아 생성능(ammonification)은 Dey 등(2004)의 방법에 의하여, siderophore 생성능은 Chrome azurol S assay (Schwyn과 Neilands, 1987)에 의하여, 식물병원성 진균 세포성분 분해효소(amylase, cellulase, chitinase, lipase, pectinase, protease)의 활성은 standard method (Gerhardt 등, 1981)에 의하여 정성 분석하였다.
성능/효과
- 및 NaCl의 농도에 따른 keratinase 활성을 조사한 결과는 Table 2에서 보는 바와 같다. KH2PO4의 농도 증가에 따라 효소 활성은 비례적으로 증가하여 0.12%에서 가장 높은 값(20.7 U/ml)을 나타내었으며, 그 이상의 농도에서는 keratinase 활성이 감소하였다. K2HPO4의 경우, 0.
- Keratinase 생산을 위해 사용한 균주는 본 실험실에서 분리 및 동정한 균주들 중 가장 높은 효소 활성을 나타내었던 P. geniculata이었다(Go 등, 2012). 이 세균은 가정의 욕실 배수구에 축적되어 있던 모발로부터 분리한 균주이다.
- 반면, 최적배지에서 배양된 실험균주는 약 6 시간의 유도기를 거친 후, 대수증식기에 도달했으며, 배양 36시간까지 지속적으로 생육하였다. Keratinase의 생산은 균체 생육과 비례하여 증가하다가 36시간 경에 31.6 U/ml의 최고 활성을 보여주어 기본배지의 4.6배에 해당하는 keratinase 생산개선효과가 있는 것으로 나타났다. 한편, 기본배지에서 우모 분해율은 56.
- 배지 성분으로 첨가한 우모의 형태, 효소반응에 사용된 기질의 종류 및 반응시간 등의 상이성으로 인하여 기 보고된 keratinase 활성과 본 실험 결과를 직접적으로 비교할 수는 없지만 Xanthomonas sp. P5(Jeong 등, 2010b)와 Bacillus subtilis S8 (Jeong 등, 2010a)에 의한 keratinase 생산은 5일과 4일이 소요된 반면, 본 실험균주에 의한 효소 생산은 24 시간 만에 이루어져 보다 짧은 단위시간에 keratinase를 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
- 이러한 결과는 keratinase 생산은 중성～알칼리성 영역에서 일어난다는 이전의 보고와 잘 일치하였다(Suntornsuk과 Suntornsuk, 2003). 결과에 제시하지는 않았지만 실험균주의 생육도는 pH 7에서 A660가 0.557을 나타내었으나 알칼리 영역인 pH 9～11에서 0.819～0.842를 나타내어 본 균주는 alkaliphile임을 알 수 있었다. 또한, 20℃에서 17.
- 4에서 보는 바와 같다. 기본배지에서 실험균주는 배양 12시간까지 생육하다가 정지기에 도달하였으며, keratinase 활성은 최고 6.8 U/ml을 나타내었다. 반면, 최적배지에서 배양된 실험균주는 약 6 시간의 유도기를 거친 후, 대수증식기에 도달했으며, 배양 36시간까지 지속적으로 생육하였다.
- 4 U/ml)을 나타내었으며, 그 이상의 농도에서 keratinase 활성은 비교적 일정하게 유지되었다. 또한 NaCl은 0.07%까지 농도에 비례하여 효소 활성(22.4 U/ml)이 증가되었으며, 그 이상의 농도에서 keratinase 활성은 감소하였다. Keratinas 생산에 영향을 미치는 것으로 알려진(Rao 등, 1998) MgSO4․7H2O 및 MgCl2․6H2O의 추가 첨가 실험을 실시한 결과, 두 무기염 모두 keratinase 활성을 증가시키는 효과가 있었다.
- 본 균주는 protease, lipase 및 chitinase 등 식물병원성 진균의 세포성분과 세포벽을 분해할 수 있는 효소를 생성할 수 있었다. 또한 본 균주는 Chrome azurol S 평판배지에서 콜로니 주위에 orange zone을 형성함에 따라 siderophore 생성능이 있음을 알 수 있었다. Siderophore는 철 이온과 결합할 수 있는 대사산물로써, 식물 병원성 진균의 생육을 억제할 뿐만 아니라 식물이 이용할 수 없는 불용성 철을 가용화시킴으로서 식물 성장에 도움을 주는 것으로 보고되어 있다(Pandey 등, 2005).
- 5에서 보는 바와 같다. 본 균주는 protease, lipase 및 chitinase 등 식물병원성 진균의 세포성분과 세포벽을 분해할 수 있는 효소를 생성할 수 있었다. 또한 본 균주는 Chrome azurol S 평판배지에서 콜로니 주위에 orange zone을 형성함에 따라 siderophore 생성능이 있음을 알 수 있었다.
- 6배 개선되었으며, 우모도 완전히 분해하였다. 본 실험균주는 protease, lipase 및 chitinase와 같은 식물병원성 진균의 세포성분 분해효소, 식물성장 호르몬인 IAA, 식물병원성 진균의 생육을 저해하는 siderophore, ammonification 등의 생리활성을 가지고 있었다. 따라서 본 균주는 우모 폐기물의 생물학적 처리를 통한 우모의 영양적 가치 향상이나 우모 폐기물의 현장에서의 분해뿐만 아니라 생물비료 개발에도 응용 가능성이 있음을 알 수 있었다.
- 본배양은 전배양액 2% (v/v)를 50 ml의 기본배지가 함유된 250 ml Erlenmeyer flask에 접종한 후, 전배양과 동일한 조건에서 배양하였다. 사용한 기본배지의 조성은 KH2PO4 0.04%, K2HPO4 0.03%, NaCl 0.05%, feather 0.1%이었으며, 초기 pH 7.0은 별도로 조정되었다.
- 4 U/ml의 keratinase가 생산되어 우모가 탄소원으로 작용했음을 알 수 있었으며, 이러한 결과는 Jeong 등(2010a)의 보고와 일치하였다. 상기 세 탄소원을 각 농도별로 첨가하여 keratinase 활성을 조사한 결과, glucose 0.15%에서 가장 높은 활성(11.0 U/ml)을 나타내었다(Fig. 1).
- 04%이었으며, 최적 배양조건은 초기 pH 10, 25℃ 및 200 rpm이었다. 최적 조건에서 keratinase 생산량은 기본배지보다 4.6배 개선되었으며, 우모도 완전히 분해하였다. 본 실험균주는 protease, lipase 및 chitinase와 같은 식물병원성 진균의 세포성분 분해효소, 식물성장 호르몬인 IAA, 식물병원성 진균의 생육을 저해하는 siderophore, ammonification 등의 생리활성을 가지고 있었다.
- 최적 탄소원이 첨가된 배지에 각종 질소원을 첨가하여 keratinase 활성을 조사한 결과, 첨가된 모든 유기질소원은 keratinase 활성을 증가시켰는데, 특히 beef extract, casamino acid 및 tryptone을 첨가했을 때 ketratinase 활성이 높았다(14.3～14.7 U/ml). 무기질소원 중 (NH4)2SO4, NH4NO3, (NH4)2HPO4, NaNO2는 keratinase 활성을 저해하거나 별다른 효과는 없었으나 그 외 무기질소원은 keratinase 활성을 증가시켰다.
- 6배에 해당하는 keratinase 생산개선효과가 있는 것으로 나타났다. 한편, 기본배지에서 우모 분해율은 56.1%를 나타내었으나 최적배지에서는 첨가된 모든 우모가 분해(100%)되었음을 알 수 있었다. 배지 성분으로 첨가한 우모의 형태, 효소반응에 사용된 기질의 종류 및 반응시간 등의 상이성으로 인하여 기 보고된 keratinase 활성과 본 실험 결과를 직접적으로 비교할 수는 없지만 Xanthomonas sp.
- Siderophore는 철 이온과 결합할 수 있는 대사산물로써, 식물 병원성 진균의 생육을 억제할 뿐만 아니라 식물이 이용할 수 없는 불용성 철을 가용화시킴으로서 식물 성장에 도움을 주는 것으로 보고되어 있다(Pandey 등, 2005). 한편, 실험균주의 IAA 생성능 및 암모니아 생성능을 조사하기 위한 실험에서 배양 상등액은 각각 분홍색과 노란색으로 변화됨에 따라 실험균주는 IAA 및 암모니아 생성능이 있음을 알 수 있었다. IAA는 대표적인 식물성장 호르몬으로써, 뿌리 신장, 과실 형성 등을 촉진하는 것으로 보고되어 있다(Khalid 등, 2004).
- 9 U/ml의 최고값을 나타내었다. 한편, 진탕속도는 keratinase 활성에 큰 영향을 미치지 않았으며, 200 rpm에서 가장 높은 활성을 나타내었다(미제시).
- geniculata의 keratinase 생산 최적조건을 OVT 방법을 통하여 조사하였다. 확립된 keratinase 생산 최적 배지 조성은 glucose 0.15%, beef extract 0.08%, KH2PO4 0.12%, K2HPO4 0.02% NaCl 0.07%, MgSO4․7H2O 0.03%, MgCl2․6H2O 0.04%이었으며, 최적 배양조건은 초기 pH 10, 25℃ 및 200 rpm이었다. 최적 조건에서 keratinase 생산량은 기본배지보다 4.
후속연구
- 본 실험균주는 protease, lipase 및 chitinase와 같은 식물병원성 진균의 세포성분 분해효소, 식물성장 호르몬인 IAA, 식물병원성 진균의 생육을 저해하는 siderophore, ammonification 등의 생리활성을 가지고 있었다. 따라서 본 균주는 우모 폐기물의 생물학적 처리를 통한 우모의 영양적 가치 향상이나 우모 폐기물의 현장에서의 분해뿐만 아니라 생물비료 개발에도 응용 가능성이 있음을 알 수 있었다.
- 한편, 일부 동물성 폐기물은 질소 비료로서 사용 가능성 높은 것으로 보고되어 있는데, 양모를 화학적으로 분해한 산물은 농작물의 성장을 촉진하며(Nustorova 등, 2005), 우모는 완효성 질소 비료로써 사용 가능성이 높은 것으로 보고되었다(Hadas와 Kautsky, 1994). 이러한 관점에서 우모를 분해하는 미생물이 식물 성장을 촉진하는 활성까지 가진다면 우모 분해산물은 보다 효율적인 친환경 생물비료로써 평가될 수 있을 것이다.
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