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문제 정의
- 본 연구에서는 항비만 및 간 기능증진 소재를 검색하기 위한 일련의 연구로 고지방식이로 유도한 비만 mouse를 실험동물 모델로 하여 항비만 및 혈중지질 개선효과를 조사하였다. 실험 식이는 전통적으로 사용되어온 Aspergillus 속의 미생물로 발효시킨 비지를 2% 첨가한 고지방식이로 6주간 사육하였다.
- 본 연구자들은 우리나라의 전통발효식품의 제조에 널리 사용되고 있는 Aspergillus oryzae 및 이들의 변이주와 Aspergillus속 중에서도 Monascus속 미생물에서와 같은 cholesterol 생합성 저해물질인 lovastatin과 같은 물질의 생성력이 높은 Aspergillus terreus와 같은 다양한 Aspergillus속의 미생물로 발효시킨 발효비지의 항비만 효과와 혈청 지질의 개선효과를 연구하였다[7].
제안 방법
- 5주 동안 고지방식이로 비만을 유도한 mouse를 Table 2에서와 같이 구분한 8개군과 기본사료만을 급여한 정상대조군의 총 9개군으로 구분하여 6주간 사육하면서 체중의 변화, 식이섭취량, 체중증가량 및 식이효율을 조사한 결과는 Fig. 2 및 Table 3과 같다. 실험식이 개시일의 각 군의 평균체중은 NC군은 23.
- 8주간 사육한 마우스는 물만 주고 12시간동안 금식시킨 후 ether 마취 하에서 복부 대동맥으로부터 채혈한 다음, 빙냉의 생리식염수로 간을 관류하고 장기를 적출 한 후 습기를 제거하고 무게를 측정하였다. 채취한 혈액은 실온에서 응고시킨 다음 4℃, 2,500×g에서 20분간 원심분리 하여 혈청을 분리한 후 적출한 간 조직과 함께 −70℃에 두면서 분석용 시료로 사용하였다.
- LPO (lipid peroxide)의 함량은 간 조직 마쇄 균질액에 thiobarbituric acid (TBA) 용액을 가하여 반응시킨 후 n-butanol을 가하여 이행되는 TBA-reactive substance를 흡광도 532 nm에서 측정한 다음 분자흡광계수 (ε=1.5×105 M−1 cm−1)를 이용하여 함량을 산출하였으며 간 조직 g 당 malondialdehyde nmole로 나타내었다[10].
- 비만이 유도된 실험동물은 Table 2에서와 같이 계속 기본사료만을 급여하는 정상식이군 (NC), 기본사료에 lard를 35%와 비 발효비지를 2%되게 혼합한 고지방식이 대조군 (HC), 기본사료에 lard 35%와 Aspergillus aculeatus KACC41842로 발효시킨 발효비지를 2%되게 혼합한 식이군 (AA), 기본사료에 lard 35%와 Aspergillus oryzae var effuses KACC44969로 발효시킨 발효비지를 2%되게 혼합한 식이군 (AE), 기본사료에 lard 35%와 Aspergillus oryzae var effuses KACC44990로 발효시킨 발효비지를 2%되게 혼합한 식이군 (AE4), 기본사료에 lard 35%와 Aspergillus oryzae KACC40247 로 발효시킨 발효비지를 2%되게 혼합한 식이군 (AO4), 기본사료에 lard 35%와 Aspergillus oryzae KFRI995로 발효시킨 발효비지를 2%되게 혼합한 식이군 (AO9), 기본사료에 lard 35%와 Aspergillus oryzae var. brunneus KACC44823로 발효시킨 발효비지를 2%되게 혼합한 식이군 (AOB) 및 기본사료에 lard 35%와 Aspergillus terreus ATCC20542로 발효시킨 발효비지를 2%되게 혼합한 식이군 (AT)의 9개군 (5마리/군)으로 구분하여 6주간 사육하였다. 실험식이는 식이 전 문제조회사인 Feeds Lab (Guri-si, Gyeonggi-do, Korea)에 의뢰하여 제조한 후 4℃에서 보관하면서 매일 신선한 식이를 공급하였다.
- 간 조직 GSH (glutathione)의 함량은 일정량의 간 조직 마쇄 균질액에 5,5'-dithibis (2-nitrobenzoic acid)를 가하여 생성되는 thiophenol의 흡광도를 측정하였으며 간 조직 g당 환원형 GSH μmole로 나타내었다[9].
- 사육장은 stainless steel cage를 사용하였고, 온도 및 습도는 23±2℃, 60±5%로 조정하였으며, 명암 주기는 12시간 간격으로 설정하였으며 음용수와 식이는 자유 섭취시켰다.
- brunneus KACC44823로 발효시킨 발효비지를 2%되게 혼합한 식이군 (AOB) 및 기본사료에 lard 35%와 Aspergillus terreus ATCC20542로 발효시킨 발효비지를 2%되게 혼합한 식이군 (AT)의 9개군 (5마리/군)으로 구분하여 6주간 사육하였다. 실험식이는 식이 전 문제조회사인 Feeds Lab (Guri-si, Gyeonggi-do, Korea)에 의뢰하여 제조한 후 4℃에서 보관하면서 매일 신선한 식이를 공급하였다. 사육장은 stainless steel cage를 사용하였고, 온도 및 습도는 23±2℃, 60±5%로 조정하였으며, 명암 주기는 12시간 간격으로 설정하였으며 음용수와 식이는 자유 섭취시켰다.
- 한편, 살균 냉각된 재료의 일부는 50℃로 조정한 열풍건조기에 넣어 2~3cm의 두께로 펴서 수분함량이 2~3% 내외가 되도록 건조시킨 후 polyethylene bag에 넣어 밀봉하여 4℃이하의 저온실에 보관하면서 발효용 재료로 사용하였다. 이와 같이 건조시킨 비지의 발효는 건조비지 100 g에 대하여 종균배양액 (108 cf ul/mL의 종균 배양액을 균체무게로 재료무게의 1%되는 양)을 살균수를 혼합하여 총량을 100~150 mL로 조정하여 최종 수분함량을 50~60%가 하였으며, 이를 상기에서와 같은 방법으로 PP-bag에 넣은 후 종균을 접종하여 발효시켰다. 발효가 완료된 발효비지는 다시 PP bag에 넣어 121℃에서 60분간 살균한 후 열풍 건조하여 식이용 사료로 사용하였다.
- 채취한 혈액은 실온에서 응고시킨 다음 4℃, 2,500×g에서 20분간 원심분리 하여 혈청을 분리한 후 적출한 간 조직과 함께 −70℃에 두면서 분석용 시료로 사용하였다.
- 체중과 식이섭취량은 전 실험기간 동안 매일 일정시간에 측정하였으며, 식이효율 (feed efficiency ratio: FER)은 1일 체중증가량을 1일 식이섭취량으로 나눈 값으로 하였다.
- 혈청중성지질, 총콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤 함량은 kit시약 (AM 157S-K, AM 202-K, AM 203-K, Asanpharm Co., Korea)으로 측정하였으며, LDL-콜레스테롤함량은 Atherogenic index (AI)는 계산식 (total cholesterol − HDL-cholesterol) / HDL-cholesterol에 의하여 산출하였다[8].
대상 데이터
- 발효비지 제조용의 재료는 재래식 방법으로 두부를 만들고 있는 경상북도 경산시 중앙동에 위치한 재래시장 내의 한 두부제조공장에서 두부제조 후 곧 바로 채취한 비지(Wet Soybean Curd Residue : SCR) 즉, 불린 국내산 대두(Glycine max)에 물을 가하여 자동화시킨 맷돌로 간 후 100℃에서 1시간동안 끓이고 천으로 된 포대에 넣어 여과하여 두부제조용의 두유를 얻고 남은 찌꺼기를 젖은 상태로 구입하여 발효용 재료로 사용하였다.
- 본 연구에서는 항비만 및 간 기능증진 소재를 검색하기 위한 일련의 연구로 고지방식이로 유도한 비만 mouse를 실험동물 모델로 하여 항비만 및 혈중지질 개선효과를 조사하였다. 실험 식이는 전통적으로 사용되어온 Aspergillus 속의 미생물로 발효시킨 비지를 2% 첨가한 고지방식이로 6주간 사육하였다. 체중은 비발효 비지를 2% 첨가한 고지방식이 군 (HC)에 비하여 AOB군은 5.
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2.4 동물실험
실험동물은 4주령의 평균체중 21~24 g의 ICR (Crljori: CD-1), SPF/VAF outbred mice (Orient Ltd., Sungnamsi, Korea)을 기본사료인 5L79 diets (PMI Nutrition, Brentwood, LA)로 1주일간 환경에 적응시킨 다음 기본사료만을 급여하는 정상 대조군과 기본사료에 lard 35%를 혼합한 고지방식이군으로 구분하여 5주간 사육하여 비만을 유도하였다. 비만이 유도된 실험동물은 Table 2에서와 같이 계속 기본사료만을 급여하는 정상식이군 (NC), 기본사료에 lard를 35%와 비 발효비지를 2%되게 혼합한 고지방식이 대조군 (HC), 기본사료에 lard 35%와 Aspergillus aculeatus KACC41842로 발효시킨 발효비지를 2%되게 혼합한 식이군 (AA), 기본사료에 lard 35%와 Aspergillus oryzae var effuses KACC44969로 발효시킨 발효비지를 2%되게 혼합한 식이군 (AE), 기본사료에 lard 35%와 Aspergillus oryzae var effuses KACC44990로 발효시킨 발효비지를 2%되게 혼합한 식이군 (AE4), 기본사료에 lard 35%와 Aspergillus oryzae KACC40247 로 발효시킨 발효비지를 2%되게 혼합한 식이군 (AO4), 기본사료에 lard 35%와 Aspergillus oryzae KFRI995로 발효시킨 발효비지를 2%되게 혼합한 식이군 (AO9), 기본사료에 lard 35%와 Aspergillus oryzae var.
- 실험에 사용한 비지메주 발효용 Aspergillus 속의 균주는 Table 1과 같으며 농촌진흥청 농업유전자원정보센터(RDA-Genebank Information Center, Suwon, Korea) 및 Korea Food Research Institute (KFRI, Sungnam, Korea)에서 구입하였다. 이들 균주는 BactoTM Malt Extract (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD 21152 USA)에 각각 이식하여 25℃의 shaking incubator에서 7일간 배양하여 배양액 mL당 108 cfu이상이 되었을 때 종균으로 사용하였다.
데이터처리
- 데이터는 실험동물 5마리에 대한 평균치와 표준편차로 나타내었다. 유의성 검증은 SPSS ver.
- 유의성 검증은 SPSS ver. 14.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) software package program을 이용하여 Duncan's multiple range test를 행하였다.
성능/효과
- 3)Values are mean ± standard deviations (n=5), different superscripts in the same column indicate significant differences (p<0.05).
- TG 함량은 모든 실험식이군이 HC군에 비하여 낮은 수치를 나타내었으며 그 중에서도 항비만 효과가 높게 나타난 AE, AE4, AO4 및 AT군에서는 HC군에 비하여 7.20~10.40%가 감소되었다. 반면에 이들 군의 TC함량은 3.
- 간 중량은 NC군이 1.36g인데 비하여 HC, AA, AE, AO9, AOB군들에서는 1.75~1.96g을 나타내었으나 AT, AO4 및 AE4군에서는 1.49~1.60 g으로 NC군의 1.36 g에는 미치지 않으나 고지방 식이로 증가된 간의 중량이 크게 감소되는 경향을 나타내었다. 부고환 주변지방의 함량도 간의 중량과 유사한 경향으로 모든 실험식이군이 HC군에 비하여 낮은 경향을 나타내었으며 특히 AE, AE4, AO4 및 AT군에서는 HC군에 비하여 30.
- 간 중량은 NC군이 1.36g인데 비하여 HC, AA, AE, AO9, AOB군들에서는 1.75~1.96g을 나타내었으나 AT, AO4 및 AE4군에서는 1.49~1.60 g으로 NC군의 1.36 g에는 미치지 않으나 고지방 식이로 증가된 간의 중량이 크게 감소되는 경향을 나타내었다. 부고환 주변지방의 함량도 간의 중량과 유사한 경향으로 모든 실험식이군이 HC군에 비하여 낮은 경향을 나타내었으며 특히 AE, AE4, AO4 및 AT군에서는 HC군에 비하여 30.
- 74g을 나타내었다. 그러나 6주후의 평균체중은 NC군이 33.55g으로 초기 체중에 비하여 43.13%가 증가하였으며, 비발효 SCR을 2% 혼합한 고지방식이 대조군인 HC군은 28.45%가 증가하였다. 그리고 실험식이군에서는 초기체중에 대한 비율(%)과 HC군에 비한 체중 감소율(%)을 산출한 결과 AOB군은 각각 21.
- 45%가 증가하였다. 그리고 실험식이군에서는 초기체중에 대한 비율(%)과 HC군에 비한 체중 감소율(%)을 산출한 결과 AOB군은 각각 21.19% 및 5.65%, AA군은 15.11% 및 10.39%, AO9군은 12.26% 및 12.65%, AE군은 2.01% 및 20.59%, AT군은 0.39% 및 21.84%, AO4군은 -3.26% 및 24.69%, AE4군은 -11.8% 및 31.33%로 특히 AE, AT, AO4 및 AE4군에서는 HC군에 비하여 20%이상의 높은 체중감소효과를 나타내었다. 이러한 결과는 이들 군에서 식이섭취량이 다소 낮게 나타난 영향도 보이나 HC군과의 뚜렷한 차이를 보지지 않음을 고려할 때 발효를 통하여 비지에 함유된 항비만 효과를 나타내는 성분들의 큰 것으로 생각된다.
- 따라서 본 실험의 결과는 Aspergillus 속 미생물로 발효시킨 비지가 ROS에 의한 간 손상을 예방하거나 치유하는 기능이 있음을 나타내며 특히 AE, AE4, AO4 및 AT에서 그 효과가 큼을 나타낸다.
- 본 연구에서도 GSH 함량은 HC군이 1.84 μ mole/g-tissue로 NC군의 3.05 μmole/g-tissue에 비하여 39.68%가 낮았으나 항비만 효과를 크게 나타낸 AE, AE4, AO4 및 AT군에서는 HC군에 비하여 45.10~60.32%가 높았다.
- 36 g에는 미치지 않으나 고지방 식이로 증가된 간의 중량이 크게 감소되는 경향을 나타내었다. 부고환 주변지방의 함량도 간의 중량과 유사한 경향으로 모든 실험식이군이 HC군에 비하여 낮은 경향을 나타내었으며 특히 AE, AE4, AO4 및 AT군에서는 HC군에 비하여 30.33~41.99%가 감소되었다.
- 실험 식이는 전통적으로 사용되어온 Aspergillus 속의 미생물로 발효시킨 비지를 2% 첨가한 고지방식이로 6주간 사육하였다. 체중은 비발효 비지를 2% 첨가한 고지방식이 군 (HC)에 비하여 AOB군은 5.65%, AA군은 10.39%, AO9군은 12.65%, AE군은 20.59%, AT군은 21.84%, AO4군은24.69%, AE4군은 31.33%가 감소하였으며 특히 AE, AT, AO4 및 AE4군이 HC군에 비하여 20% 이상의 높은 체중감소효과를 나타내었다. 이러한 효과는 식이섭취량이 다소 낮은데도 영향이 있는 것으로 보이나 식이섭취량이 HC군과 뚜렷한 차이를 보지지 않음을 고려할 때 발효를 통하여 비지에 함유된 항비만 효과를 나타내는 성분들의 큰 것으로 생각된다.
- 41%가 감소하였다. 한편 HDL-cholesterol 함량은 모든 실험식이군이 HC군에 비하여 높은 함량을 보였으며 그 중에서도 AE, AE4, AO4 및 AT군에서는 HC군에 비하여 44.11~67.64%가 증가하였으며 LDL-cholesterol 함량은 24.64~50.73%가 감소하여 Aspergillus 속 곰팡이로 발효시킨 비지가 고지방식이 및 이로부터 유도한 비만에서 혈중지질의 개선효과와 함께 동맥경화와 같은 생활습관병을 개선시키는 효과가 있는 것으로 판단된다.
- 41%가 감소하였다. 한편 HDL-cholesterol 함량은 모든 실험식이군이 HC군에 비하여 높은 함량을 보였으며 그 중에서도 AE, AE4, AO4 및 AT군에서는 HC군에 비하여 44.11~67.64%가 증가하였으며 LDL-cholesterol 함량은 24.64~50.73%가 감소하여 Aspergillus 속 곰팡이로 발효시킨 비지가 고지방식이 및 이로부터 유도한 비만에서 혈중지질의 개선효과와 함께 동맥경화와 같은 생활습관병을 개선시키는 효과가 있는 것으로 판단된다.
- 또한 LPO함량은 GSH의 함량과 반대의 결과를 보였다. 혈중 TG 함량은 모든 실험식이군이 HC군에 비하여 낮은 수치를 나타내었으며 그 중에서도 항비만 효과가 높게 나타난 AE, AE4, AO4 및 AT군에서는 HC군에 비하여 7.20~10.40%가 감소되었다. 반면에 이들 군의 TC함량은 3.
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