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문제 정의
- 본 연구에서는 GYE와 GYF가 비만에 미치는 영향을 알아보고자 3T3-L1 지방전구세포가 분화하는 단계에 처리하여 지방 분화 억제 효과와 그 기전을 확인하였고, 동물 실험을 통해 고지방 식이 비만 쥐의 체중변화와 혈중 지질농도의 변화를 확인하였다.
- 이에 저자는 GYE와 GYF가 고지방 식이의 비만 쥐에 미치는 세포독성 여부, 체중 변화, 혈중지질농도의 변화, 지방세포 분화와 지방세포 분화 주요 조절 인자인 peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ)와 CCAAT/enhancer binding protein alpha(C/EBPα)의 발현에 미치는 영향에 대하여 실험한 바 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 2) 고지방 식이, 3) 고지방 식이+GYE, 4) 고지방 식이+GYF를 투여한 군으로 설정하였다.
- 동물군은 총 4군 즉1) 일반 식이, 2) 고지방 식이,3) 고지방 식이+GYE, 4) 고지방 식이+GYF로 설정하였다. 4주간 60% 고지방 식이를 통해 비만 유도 후 5주째부터 20주까지 100mg/Kg/day 용량으로 각 약재를 섞은 고지방 식이를 자유롭게 섭취하게 한 후, 20주째에 동물의 혈청에서 총 콜레스테롤, HDL, LDL, Triglyceride (TG), BUN, Creatin, Glucose를 측정하였다.
- 5% skim milk로 blocking한 후 여러 가지 1차 항체 (PPAR γ, CEB/Pα) 및 horseradish peroxidase (Jackson Lab.) 가 부착된 2차 항체로 반응시키고 ECL 용액 (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)을 사용하여 목적 단백질을 확인하였다.
- GYE와 GYF를 3T3-L1 지방세포에 처리 후 지방세포 분화 억제 정도를 측정하였다. 분화 억제 정도는 Oil-Red-O측정법을 통하여 확인하였고, 지방세포 분화 인자발현 정도는 Real-time RT-PCR과 Western blot으로 확인하였다.
- Oil red O 실험을 통해서 각 약물 농도별 분화 억제 정도를 알아보았다.
- 加味二陳湯 2첩에 물 2500ml를 넣어서 발효기 (서울 우성금속 제작)에서 100° C 로 끓여서 85° C 로 온도를 낮추어 약 10시간 달인 후 50° C 로 식힌 상태에서 복합 발효균 (청주 중앙미생물 연구소 제품: 바실러스 효모 유산균 포함)을 넣어서 스위치를 끄고 48시간 발효 숙성하여 나온 발효액 960ml를 얻었다.
- 加味二陳湯 전탕액 (GYE)과 발효액 (GYF)을 이용하여 고지방 식이 비만 쥐의 지방세포 분화 억제 정도와 체중변화, 혈중지질 농도의 변화를 비교 분석한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 검증 물질을 처리하여 분화된 3T3-L1 adipocytes가 in vivo adipocytes의 생화학적 형태학적 성질들과 사실상 동일하다는 보고63)에 따라 3T3-L1 세포주가 분화에 비례하여 지방이 축적되는 성질을 역이용하여 GYE와 GYF를 3T3-L1에 처리한 후에 세포분화 정도를 관찰하여 항비만 효과를 검증하였다. 세포독성평가는 MTT assay를 이용해 GYE, GYF를 각각 농도별 (0.
- 단백질 발현 양의 변화는 3T3-L1 세포 분화를 유도하면서 GYE, GYF을 농도별 (0.01, 0.1mg/ml)로 처리하고 단백질 level에서의 Western blot analysis를 시행하여 PPARγ과 C/EBPα의 발현 억제 효과를 확인할 수 있었다.
- 동물군은 총 4군 즉1) 일반 식이, 2) 고지방 식이,3) 고지방 식이+GYE, 4) 고지방 식이+GYF를 투여한 군으로 설정하였다. 마우스에 4주간 60% 고지방 식이를 통해 비만 유도 후 5주째부터 20주까지 100 mg/Kg/day 용량 (성인 60 kg일 때 하루 섭취량 (8g/60kg/day)을 기준으로 산정)으로 투여한 약물 투여 군과 고지방 사료만 투여한 대조군에서 몸무게 변화를 측정하였다.
- 동물군은 총 4군 즉1) 일반 식이, 2) 고지방 식이, 3) 고지방 식이+GYE, 4) 고지방 식이+GYF를 투여한 군으로 설정하였다. 마우스에 4주간 60% 고지방 식이를 통해 비만 유도 후 5주째부터 20주까지 100mg/kg/day 용량 (성인 60kg일 때 하루 섭취량 (8g/60kg/day)을 기준으로 산정)으로 투여한 약물 투여 군과 고지방 사료만 투여한 대조군에서 몸무게 변화를 측정하였다.
- 동물군은 총 4군 즉1) 일반 식이, 2) 고지방 식이,3) 고지방 식이+GYE, 4) 고지방 식이+GYF를 투여한 군으로 설정하였다. 마우스에 4주간 60% 고지방 식이를 통해 비만 유도 후 5주째부터 20주까지 100mg/kg/day 용량으로 약물이 섞인 고지방 식이를 자유롭게 섭취하게 한 후, 20주째에 동물의 혈청에서 총 콜레스테롤, HDL, LDL, Triglyceride, BUN, Creatin, Glucose를 측정하였다.
- 마우스에 4주간 60% 고지방 식이를 통해 비만 유도 후 5주째부터 20주까지 각 약재를 100mg/kg/day 용량(성인 60kg일 때 하루 섭취량 (≃8g/60kg/day)을 기준으로 산정)으로 투여한 약물 투여군과 고지방 사료만 투여한 대조군에서 몸무게 변화를 측정하였다. 일반식이와 고지방 식이의 kg 당 조성의 내용과 분량은 다음과 같다 (Table 2).
- 에 따라 3T3-L1 세포주가 분화에 비례하여 지방이 축적되는 성질을 역이용하여 GYE와 GYF를 3T3-L1에 처리한 후에 세포분화 정도를 관찰하여 항비만 효과를 검증하였다. 세포독성평가는 MTT assay를 이용해 GYE, GYF를 각각 농도별 (0.01, 0.1, 1㎎/㎖)로 3T3-L1 세포에 24시간동안 처리하여 실험을 진행하였다. 그 결과 GYE는 모든 농도에서 대조군에 비해 세포 독성이 나타나지 않았으나, GYF는 1㎎/㎖농도에서 세포 독성이 나타났다.
- 세포를 60% Oil-Red-O로 30분간 염색하였다. 세포질 내 붉은색 과립이 있는 세포를 분화된 지방세포로 간주하고, 염색된 Oil-Red-O를 100% 이소프로판올로 녹여내어 500 nm에서 흡광도를 측정하여 지방세포의 분화정도를 측정하였다.
- 실험 시작부터 5마리는 일반 식이를 급여하고, 10마리는 고지방 식이를 4주간 급여하여 비만을 유도하고, 5주째부터 비만식이에 약재를 섞어서 16주간 급여하였다.
- 실험시작 전 1주일 동안 일반 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경 (23 ± 2℃, 습도 55 ± 5%)으로 유지하고 12시간씩 명암을 자동 조절하여 적응시켰다.
- 실험에 사용된 각 약물이 지방세포의 생존율에 미치는 영향을 관찰하기 위해 MTS assay를 진행하였다. 그 결과, GYE는 0.
- 실험을 통해 GYE, GYF가 PPARγ, C/EBPα의 adipogenic transcription factor들의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 mRNA 및 단백질 발현 양을 통해서 확인하였다.
- 전지방세포는 분화유도물질인 인슐린 (1 ㎍/㎖), dexamethasone (DEX, 1μM), 1-methyl-3-methylxanthine(IBMX, 0.5mM) 이 함유된 분화유도 배양액으로 교환하여 2일간 배양하여 지방세포로 분화를 유도하고, 배양 2일 후 인슐린만 함유하는 배지로 교환하고 약물을 처리하여 2일간 배양하였다.
- 지방세포를 분화시켜 약물을 농도별로 처리한 후, QIA Zol Lysis reagent를 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 template로 power cDNA synthesis kit(Intron)를 이용하여 single stranded cDNA를 제조하였다.
- 지방세포를 분화시켜 약물을 농도별로 처리한 후, QIA Zol Lysis reagent를 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 template로 power cDNA synthesis kit(Intron)를 이용하여 single stranded cDNA를 제조하였다. 발현정도는 DNA에 유전자를 특이적으로 증폭하는 PPARγ, C/EBPα primers를 넣어 Real-time PCR 방법을 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 加味二陳湯 전탕액 (GYE)과 加味二陳湯 발효액 (GYF)은 원광대학교 부속 전주 한방병원에서 구입하여 사용하였고, GYF는 GYE를 다음과 같은 방법으로 발효하여 사용하였다. 처방 1첩의 내용과 용량은 다음과 같다 (Table 1).
- 세포 배양액은 10% fetal bovine serum (FBS)과 항생제(antibiotics)가 포함된 Dulbecco's modified Eagle's media(DMEM)을 사용하였다.
- 실험동물은 식이로 비만이 유도되는 형질을 가진 C57/BL6종의 4주령 된 생쥐 30마리를 대한 바이오 링크로부터 구입하여 사용하였다. 실험시작 전 1주일 동안 일반 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경 (23 ± 2℃, 습도 55 ± 5%)으로 유지하고 12시간씩 명암을 자동 조절하여 적응시켰다.
데이터처리
- 실험 결과는 각 실험에 대한 평균값 ± S. E. M. 로 표기 하였고, 각 그룹간의 차이를 결정하기 위한 통계분석은 Independent t-Test를 이용하였다.
이론/모형
- 발현정도는 DNA에 유전자를 특이적으로 증폭하는 PPARγ, C/EBPα primers를 넣어 Real-time PCR 방법을 이용하여 측정하였다.
- GYE와 GYF를 3T3-L1 지방세포에 처리 후 지방세포 분화 억제 정도를 측정하였다. 분화 억제 정도는 Oil-Red-O측정법을 통하여 확인하였고, 지방세포 분화 인자발현 정도는 Real-time RT-PCR과 Western blot으로 확인하였다.
- 지방세포로 분화된 세포내의 지방축적은 Oil-Red-O 염색법을 이용하여 측정되었다. 세포를 10 % 포름알데하이드 (formaldehyde)로 1시간동안 고정시킨 후 60%이소프로판올 (isopropylalcohol) 액으로 세척하였다.
성능/효과
- 1. GYE와 GYF 0.01mg/ml, 0.1mg/ml, 1mg/ml의 농도에서 세포독성검사를 시행한 결과, GYE는 1mg/ml까지 독성이 없었으나 GYF는 1mg/ml에서 세포 독성이 있었다.
- 2. GYE와 GYF는 지방세포의 지방축적을 유의성 있게 억제하였고, 지방세포 분화조절인자인 PPAR-γ와 CEBPα의 발현역시 RNA level과 단백질 level에서 억제하였다.
- 3. 고지방 식이로 유도한 비만 동물모델에서 GYE와 GYF는 모두 혈중 콜레스테롤 (HDL, LDL), TG, Glucose 등을 유의성 있게 억제하였고, 특히 콜레스테롤에서는 GYF가 GYE보다 더 높은 억제 효과를 보였다.
- 3T3-L1 adipocyte에 GYE, GYF를 처리하여 지방세포 분화조절인자인 PPAR-γ와 C/EBP-α 발현 정도를 western blot analysis를 통해 측정한 결과, 단백질 level에서도 역시 GYE, GYF 모두 PPAR-γ 뿐만 아니라 C/EBP-α 발현 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 3T3-L1 adipocyte에 GYE를 처리하여 지방세포 분화 조절인자인 PPAR-γ, C/EBP-α 정도를 측정한 결과, GYE 0.01mg/ml에서부터 농도 의존적으로 PPAR-γ, C/EBP-α 발현 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다 (Fig. 4, 5).
- 3T3-L1 adipocyte에 약물을 처리하여 분화 억제 정도를 측정한 결과, GYE는 0.1mg/ml과 1mg/ml 에서 GYF는 0.1g/ml에서 지방세포 분화 억제 효과를 나타냄을 확인하였다 (Fig. 3).
- Oil red O를 통해 분화된 세포 내의 중성지방의 양을 측정하여 지방세포의 분화 억제 효과를 관찰한 결과, 대조군에 비해 GYE와 GYF 처리시 지방세포 분화를 유의성 있게 억제하였다.
- 고지방 식이로 마우스에서 비만을 유도한 후 GYE 와 GYF 투여군의 체중변화를 측정한 결과, GYE와 GYF 투여군 모두에서 비만 억제 효과를 확인하였다. 그러나 GYE와 GYF투여군 간에는 큰 차이를 보이지는 않았다 (Fig.
- 고지방 식이로 비만 유도 후 GYF와 GYE 투여군과 고지방 식이만 유지한 군, 일반 식이만 준 대조군의 각각 갈색지방의 무게, 간 무게, 부고환 지방 무게를 비교한 결과, 고지방 식이+GYE, 고지방 식이+GYF 그룹에서 부고환지방량이 유의하게 감소함을 확인하였다 (Fig. 10).
- 1, 1㎎/㎖)로 3T3-L1 세포에 24시간동안 처리하여 실험을 진행하였다. 그 결과 GYE는 모든 농도에서 대조군에 비해 세포 독성이 나타나지 않았으나, GYF는 1㎎/㎖농도에서 세포 독성이 나타났다.
- 실험에 사용된 각 약물이 지방세포의 생존율에 미치는 영향을 관찰하기 위해 MTS assay를 진행하였다. 그 결과, GYE는 0.01mg/ml에서 1mg/ml까지 세포독성이 없음을 확인하였고, GYF는 1mg/ml에서 세포독성이 있음을 확인하였다 (Fig. 1, 2).
- 그 결과, 고지방 식이+GYE 고지방 식이+GYF 투여군에서 통계적으로 유의하게 혈중 콜레스테롤, TG, LDL 등을 감소시켰고, 특히 혈중 콜레스테롤에서는 GYF의 경우 GYE보다 더 높은 억제 효과를 보였다(Fig. 11).
- 동물실험에서 GYE와 GYF는 모두 유의성 있게 혈중 콜레스테롤 (HDL, LDL), TG, Glucose등을 낮추는 효과를 보였고, 특히 콜레스테롤에서는 GYF의 경우 GYE보다 더 높은 억제 효과를 보였다.
- GYE와 GYF는 지방세포의 지방축적을 유의성 있게 억제하였고, 지방세포 분화조절인자인 PPAR-γ와 CEBPα의 발현역시 RNA level과 단백질 level에서 억제하였다. 또한 고지방 식이로 유도한 비만 동물모델에서 GYE와 GYF 모두 비만마우스의 체중증가를 억제하였다. 그러나 GYF는 GYE에 비하여 탁월한 효과를 나타내지는 않았다.
- 먼저 3T3-L1 세포 분화를 유도하면서 GYE, GYF을 농도별 (0.01, 0.1mg/ml)로 처리하였고 지방세포 분화 6일 후 PPAR-γ, C/EBP-α를 측정하는 Real-Time PCR을 실시하여 PPARγ의 발현 정도를 측정한 결과, GYE, GYF에서 유의성 있게 PPARγ의 mRNA 발현을 억제하였고 PPARγ 전사 활성을 감소시키는 것을 확인하였다.
- 본 연구에서는 고지방 식이 마우스에서 비만을 유도한 후 체중 변화를 관찰하여 GYE GYF의 비만 억제 효과를 비교한 결과, GYE와 GYF 사이에 큰 차이는 보이지 않았다.
- 이상의 연구 결과로 보아 GYE와 GYF는 고지방 식이 비만 쥐의 체중증가 억제와 함께 지방세포 분화 억제, PPARγ와 C/EBPα의 발현 억제를 시켰으며, 혈중 LDL-콜레스테롤 농도의 감소 등 지방대사에 관련된 지표를 유의성 있게 감소시켰다. 이로써 GYE와 GYF에 생체 내의 지방축적을 억제하는 성분이 함유되어 있음을 규명하였다.
- 이상의 연구 결과로 보아 GYE와 GYF는 고지방 식이 비만 쥐의 체중증가 억제와 함께 지방세포 분화 억제, PPARγ와 C/EBPα의 발현 억제를 시켰으며, 혈중 LDL-콜레스테롤 농도의 감소 등 지방대사에 관련된 지표를 유의성 있게 감소시켰다.
- 전탕액과 발효액의 효과비교를 위하여 3T3-L1 adipocyte에 GYE 또는 GYF를 처리하여 지방세포 분화조절인자인 PPAR-γ, C/EBP-α정도를 측정하여 비교한 결과, PPAR-γ와 C/EBP-α 모두 0.1mg/ml의 같은 농도에서 GYE와 GYF가 유사한 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.
- 즉, 0.1mg/ml의 GYE는 PPAR-γ 유전자 발현을 대조군에 비해 16.96% 억제하였고, 0.1mg/ml의 GYF 는 18.18% 억제하였다.
후속연구
- 이러한 결과로 加味二陳湯 전탕액 (GYE)과 발효액(GYF)은 고지방식으로 인한 비만에 유효하게 활용 가능할 것으로 사료된다.
- 이처럼 비만으로 인한 사회적 비용의 증가와 양방 비만치료에 사용되는 약물들이 가지는 독성 때문에 장기간 복용하여도 부작용이 없이 비만을 치료하거나 합병증을 개선시킬 수 있으며 더 나아가 비만을 예방할 수 있는 안전하고 경제적인 한약의 개발이 필요하다.
- 향후 이를 바탕으로 加味二陳湯 전탕액 (GYE)과 발효액 (GYF)의 비만 억제 효과에 대한 임상적 연구와 가미된 개별 약물의 비만 억제 효과에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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