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문제 정의
- 들은 주로 지질함량에 미치는 효과에 대한 연구가 대부분으로 지방 세포 분화조절에 관련하여 세포 수준에서 大柴胡湯이 비만에 미칠 수 있는 영향에 대해서는 연구된 바가 없었다. 따라서 저자는 大柴胡湯의 효능과 적응증 및 구성약물의 약리작용을 통해 cell level에서도 작용을 나타낼 것으로 판단하여 3T3-L1 지방전구세포를 이용하여 大柴胡湯이 지방세포 증식과 그 분화기 전 조절에 미치는 영향에 대하여 살펴보았다.
- 본 연구 결과는 지질대사와 비만 관련 유전자 및 단백질의 발현을 조절하는 大柴胡湯의 비만 치료제로서의 활용 가능성을 제시한다. 향후 이를 바탕으로 한 임상적 연구와 개별 약물의 유효 성분과 작용 기전 등에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는 DSH가 지방세포 분화조절인자인 PPAR#와 C/EBPα의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 유전자 및 단백질 발현량에서 확인하였다.
- 이에 저자는 3T3-L1 지방전구세포와 고지방식이 유도 비만 동물모델을 이용하여 大柴胡湯 (DSH)이 지방세포 증식과 그 분화기전 조절에 미치는 영향에 대하여 연구하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 동물군은 총 4군, 즉 1) 일반식이, 2) 고지방식이, 3) 고지방식이 + DSH, 4) 고지방식이 + EGCG (positive control)를 투여한 군으로 설정하였다. 마우스에 4주간 60% 고지방식이를 통해 비만 유도 후 5주째부터 14주까지 100 ㎎/㎏/day 용량으로 투여한 약물 투여군과 고지방사료만 투여한 대조군에서 몸무게 변화를 측정하였다.
- 동물군은 총 4군 즉 1) 일반식이, 2) 고지방식이, 3) 고지방식이 + DSH, 4) 고지방식이 + EGCG1) (positive control)를 투여한 군으로 설정하였다.
- 5% skim milk로 blocking한 후 여러 가지 1차 항체 (PPAR#, C/EBPα) 및 horseradish peroxidase (Jackson Lab.)가 부착된 2차 항체로 반응시키고 ECL 용액 (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)을 사용하여 목적 단백질을 확인하였다.
- DSH를 3T3-L1 세포에 처리 후 지방세포 분화억제 정도를 측정하였다. 분화억제 정도는 Oil-Red-O 측정법을 통하여 확인하였고, 지방세포 분화인자 발현 정도는 Real-time RT-PCR과 Western blot으로 확인하였다.
- Oil-Red-O 측정을 통해서 DSH의 농도별 분화억제 정도를 알아보았다. 3T3-L1 preadipocyte에 DSH를 처리하여 분화억제 정도를 측정한 결과, DSH 0.
- 大柴胡湯(DSH)을 이용하여 지방세포 분화억제 정도와 고지방식이 유도 비만쥐의 체중 변화, 혈중지질 농도의 변화를 비교 분석한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 동물군은 총 4군, 즉 1) 일반식이, 2) 고지방식이, 3) 고지방식이 + DSH, 4) 고지방식이 + EGCG (positive control)를 투여한 군으로 설정하였다. 마우스에 4주간 60% 고지방식이를 통해 비만 유도 후 5주째부터 14주까지 100 ㎎/㎏/day 용량으로 DSH가 섞인 고지방식이를 자유롭게 섭취하게 한 후, 14주째에 동물의 혈청에서 Total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, Triglyceride, Fructosamine, Glucose를 측정하였다.
- 동물군은 총 4군, 즉 1) 일반식이, 2) 고지방식이, 3) 고지방식이 + DSH, 4) 고지방식이 + EGCG (positive control)를 투여한 군으로 설정하였다. 마우스에 4주간 60% 고지방식이를 통해 비만 유도 후 5주째부터 14주까지 100 ㎎/㎏/day 용량으로 투여한 약물 투여군과 고지방사료만 투여한 대조군에서 몸무게 변화를 측정하였다.
- 마우스에 4주간 60% 고지방식이를 통해 비만 유도 후 5주째부터 14주까지 각 약재를 100 ㎎/㎏/day 용량(성인 60 kg일 때 하루 섭취량(≃8g/60kg/day)을 기준으로 산정)으로 투여한 약물 투여군과 고지방사료만 투여한 대조군에서 몸무게 변화를 측정하였다. 일반식이 (Con)와 고지방식이 (HFD)의 kg당 조성의 내용과 분량은 다음과 같다 (Table 2).
- 세포를 60% Oil-Red-O로 30분간 염색하였다. 세포질 내 붉은색 과립이 있는 세포를 분화된 지방세포로 간주하고, 염색된 Oil-Red-O를 100% 이소프로판올로 녹여내어 500 ㎚에서 흡광도를 측정하여 지방세포의 분화정도를 측정하였다.
- 실험 시작 전 1주일 동안 일반 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경(23 ± 2 ℃, 습도 55 ± 5%)으로 유지하고 12시간씩 명암을 자동 조절하여 적응시켰다.
- 실험 시작부터 5마리는 일반식이를 급여하고, 10마리는 고지방식이를 4주간 급여하여 비만을 유도하고 5주째부터 비만식이에 약재를 섞어서 10주간 급여하였다.
- 실험에 사용된 DSH가 지방세포의 생존율에 미치는 영향을 관찰하기 위해 MTS assay를 진행하였다. 그 결과 DSH 0.
- 실험에 사용된 DSH가 지방세포의 생존율에 미치는 영향을 관찰하기 위해 MTS assay를 진행한 결과 DSH 0.01 ㎎/㎖에서 1 ㎎/㎖까지 대조군에 비하여 세포독성을 나타내지 않아 각 농도에서 지방세포 분화에 대한 DSH의 효과를 실험하였다.
- 지방분화 진행 중 발현되는 전사인자인 PPAR#와 C/EBPα에 미치는 영향을 알아보기 위해 Real-time RT-PCR을 수행하였다.
- 지방세포 분화억제 효과 탐색을 위한 약물 처리 농도 결정을 하기 위해 96 well plate에서 MTS assay를 수행한다. 각 약물을 처리한 세포를 48시간 배양하고 MTS 시약 10 ㎕를 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 incubator에 4시간 반응시킨 후 490 ㎚에서 microplater reader로 흡광도를 측정하였다.
- 와 C/EBPα에 미치는 영향을 알아보기 위해 Real-time RT-PCR을 수행하였다. 지방세포를 분화시켜 약물을 농도별로 처리한 후, QIAZol Lysis reagent를 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 template로 power cDNA synthesis kit (Intron)를 이용하여 single stranded cDNA를 제조하였다.
- 지방세포를 분화시켜 약물을 농도별로 처리한 후, QIAZol Lysis reagent를 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 template로 power cDNA synthesis kit (Intron)를 이용하여 single stranded cDNA를 제조하였다. 발현 정도는 DNA에 유전자를 특이적으로 증폭하는 PPAR#, C/EBPα primers를 넣어 Real-time RT-PCR 방법을 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 약재는 경희대학교 한방병원에서 구입하였고, 大柴胡湯 (DSH)의 처방 내용과 1貼 분량은 Table 1과 같다.
- 실험동물은 식이로 비만이 유도되는 형질을 가진 C57BL/6종의 4주령 된 생쥐 15마리를 대한바이오링크로부터 구입하여 사용하였다. 실험 시작 전 1주일 동안 일반 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경(23 ± 2 ℃, 습도 55 ± 5%)으로 유지하고 12시간씩 명암을 자동 조절하여 적응시켰다.
데이터처리
- 실험 결과는 각 실험에 대한 평균값 ± S.E.M. 로 표기하였고, 각 그룹 간의 차이를 결정하기 위한 통계분석은 Independent t-Test를 이용하였다.
이론/모형
- 발현 정도는 DNA에 유전자를 특이적으로 증폭하는 PPAR#, C/EBPα primers를 넣어 Real-time RT-PCR 방법을 이용하여 측정하였다.
- DSH를 3T3-L1 세포에 처리 후 지방세포 분화억제 정도를 측정하였다. 분화억제 정도는 Oil-Red-O 측정법을 통하여 확인하였고, 지방세포 분화인자 발현 정도는 Real-time RT-PCR과 Western blot으로 확인하였다.
- 지방세포로 분화된 세포 내의 지방을 염색하여 분화정도를 측정하기 위하여 Oil-Red-O 염색법을 수행하였다. 세포를 10% 포름알데하이드(formaldehyde)로 1시간 동안 고정시킨 후 60% 이소프로판올(isopropylalcohol)액으로 세척하였다.
성능/효과
- 1. DSH는 약물처리 농도에서 세포독성이 없음을 확인하였다.
- 2. DSH는 지방세포의 분화를 농도 의존적으로 억제하였다.
- 3. DSH는 PPAR#와 C/EBPα의 유전자 및 단백질 발현을 농도 의존적으로 억제하였다.
- Oil-Red-O 측정을 통해서 DSH의 농도별 분화억제 정도를 알아보았다. 3T3-L1 preadipocyte에 DSH를 처리하여 분화억제 정도를 측정한 결과, DSH 0.01 ㎎/㎖에서 1 ㎎/㎖까지 농도 의존적으로 지방세포 분화억제 효과를 나타냄을 확인하였다 (Fig. 3).
- 3T3-L1 세포 분화를 유도하면서 DSH를 농도별 (0.01, 0.1, 1 ㎎/㎖) 로 처리하고 지방세포 분화 6일 후 Real-time RT-PCR 을 실시하여 PPAR# 및 C/EBPα의 유전자 발현 정도를 측정한 결과, DSH가 농도 의존적으로 PPAR# 및C/EBPα의 유전자 발현을 억제하는 것으로 나타났다.
- 3T3-L1 세포에 DSH를 처리하여 지방세포 분화조절 인자인 PPAR#, C/EBPα의 유전자 발현 정도를 측정한 결과, DSH 0.01 ㎎/㎖에서부터 농도 의존적으로 PPAR#, C/EBPα 유전자 발현 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다 (Fig. 4, 5).
- 3T3-L1 세포에 DSH를 처리하여 지방세포 분화조절인자인 PPAR#와 C/EBPα의 단백질 발현 정도를Western blot analysis를 통해 측정한 결과, 단백질 level에서도 역시 PPAR#와 C/EBPα 발현 억제 효과를 확인할 수 있었다 (Fig.
- 4. DSH 투여군에서 가장 유의성 있는 체중감소 효과를 확인할 수 있었다.
- 5. DSH 투여군에서 혈중 Glucose, Total cholesterol 및 LDL-cholesterol 농도가 통계적으로 유의하게 감소하였다.
- DSH를 3T3-L1 세포에 처리한 후 Oil-Red-O 측정법을 통하여 지방세포 분화억제 정도를 측정한 결과, DSH 0.01 ㎎/㎖에서 1 ㎎/㎖까지 농도 의존적으로 지방세포 분화를 억제하였다. 따라서 DSH가 3T3-L1 지방세포 분화유도과정에서 지방이 축적되는 정도를 유의하게 감소시킨다는 것을 알 수 있었다.
- 고지방식이로 마우스에서 비만을 유도한 후 DSH 투여군의 체중 변화를 측정한 결과, DSH 투여군에서 DSH 투여 5주 이후부터 체중증가에 있어서 감소 효과를 확인하였고, 9주 이후부터 통계적으로 유의한 비만 억제 효과를 확인하였다.
- 고지방식이로 마우스에서 비만을 유도한 후 체중 변화를 측정한 결과, DSH 투여군에서 약물 투여 5주 (실험 9주) 이후부터 체중증가에 있어서 감소 효과를 확인하였고, DSH 투여 9주 (실험 13주) 이후부터 통계적으로 유의한 비만 억제 효과를 확인하였다 (Fig. 7).
- 고지방식이로 마우스에서 비만을 유도한 후 혈중지질농도 변화를 측정한 결과, 고지방식이 + DSH 투여군에서 통계적으로 유의하게 혈중 Glucose, Total cholesterol 및 LDL-cholesterol이 감소함을 확인하였다 (Fig. 8).
- 실험에 사용된 DSH가 지방세포의 생존율에 미치는 영향을 관찰하기 위해 MTS assay를 진행하였다. 그 결과 DSH 0.01 ㎎/㎖에서 1 ㎎/㎖까지 세포독성이 없음을 확인하였다 (Fig. 2).
- 01 ㎎/㎖에서 1 ㎎/㎖까지 농도 의존적으로 지방세포 분화를 억제하였다. 따라서 DSH가 3T3-L1 지방세포 분화유도과정에서 지방이 축적되는 정도를 유의하게 감소시킨다는 것을 알 수 있었다. 지방세포의 형성과정은 전지방세포의 증식과정, 전지방세포로부터 지방세포로의 분화과정, 그리고 성숙 과정으로 크게 대별할 수 있고, 각각의 단계는 여러 인자에 의해서 억제되고 있다.
- 또한 3T3-L1 세포에 DSH를 처리하여 PPAR#와 C/EBPα 단백질 발현 정도를 western blot analysis를 통해 측정한 결과, DSH가 단백질 level에서도 PPAR#와 C/EBPα 발현 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서 고지방식이 유도 비만쥐에 5주 때부터 DSH를 첨가하여 14주까지 급여한 후 혈중지질농도 변화를 관찰한 결과, 고지방식이 + DSH 투여군에서 통계적으로 유의하게 혈중 Glucose, Total cholesterol 및 LDL-cholesterol이 감소하여 DSH가 지질대사 개선에 효과적으로 작용함을 확인할 수 있었다.
- 이상을 종합하여 보면, 大柴胡湯이 지질대사에 관여하여 작용하며 지방세포 분화과정을 억제하는 작용이 있고 그 기전은 PPAR# 및 C/EBPα의 발현 억제와 관련이 있는 것으로 사료된다.
- 종합하면 大柴胡湯은 고지방식이로 유도되는 비만을 억제하였으며 그 기전에 PPAR# 및 C/EBPα의 발현 억제가 관여하는 것으로 사료된다.
후속연구
- 본 연구 결과는 지질대사와 비만 관련 유전자 및 단백질의 발현을 조절하는 大柴胡湯의 비만 치료제로서의 활용 가능성을 제시한다. 향후 이를 바탕으로 한 임상적 연구와 개별 약물의 유효 성분과 작용 기전 등에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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