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문제 정의
- 본 연구에서는 동의보감 [21]에 근거한 간의 해독에 관련된 약용작물의 추출물을 이용하여 이를 알코올과 함께 마우스에 투여하였을 때 나타나는 생리학적인 효과를 관찰하고 독성 중간 대사산물인 aldehyde를 정량하여 알코올 섭취 후 나타나는 숙취를 해소할 수 있는 효능을 규명하고자 하였다.
- 본 연구에서는 숙취 해소에 효능이 있는 약용식물을 동의 보감 [21]에 근거하여 선별한 후 이들의 추출물로 숙취 해소 음료를 개발하여 마우스에 대한 숙취 해소 효능을 관찰하였다. 많은 경우에서 미생물에 의한 발효가 지표 물질들을 활성이 더 높은 물질로 대사시키므로 본 연구에서는 선별한 약용식물의 추출물을 균주(유산균, 효모, 납두균 함유)로 발효 시켜 발효액과 미발효액의 숙취 해소 효능을 비교하였다.
제안 방법
- 즉, 1차로 홍삼과 콩나물을 추출 농축하였고, 2차로 구기자, 갈근 등의 추출 농축액과 혼합하였다. 3차로 건강, 산사 등의 추출 농축액과 혼합하여 최종액을 제조한 후 균주(유산균, 효모, 납두균 함유)를 가하여 섭씨 40도에서 48시간 동안 발효시킨 혼합액을 물과 2:8의 비율로 혼합하였다. 시제품은 미발효액과 발효액으로 구분하여 제작되었으며 본 연구에서는 두 시제품의 생리학적 활성을 비교 측정하였다.
- HPLC분석을 통하여 미발효액과 발효액의 피크 크기를 230, 280 nm에서 비교한 결과 retention time 7.7 min와 10.5 min에서 주요 피크를 관찰하였다(Fig. 1, Table 1 and 2). 230 nm에서 관찰한 retention time 7.
- Locomotor activity test 이후에 마우스를 희생시켜서 마우스의 후대 정맥에서 혈액을 채혈하였다. 채혈한 혈액은 상온에서 방치시킨 후 600 × g로 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하고 −70℃에 보관하여 이후 acetaldehyde의 농도 측정에 사용하였다.
- Rota-rod test는 5개의 회전축(폭 12 cm, 지름 6 cm)이 격리되어 장착된 Rota-Rod Treadmill DJ-345(Daejong Instrument Industry, Korea)를 이용하여 각 마우스의 runningtime을 측정하였다. 본 실험에 앞서서 마우스를 4 rpm(1.
- 급성 독성 평가는 약재를 마우스(군당 10마리)에 한 번 경구투여(500, 5,000, 15,000 mg/kg)하여 급성 독성을 평가하였다. 2주간 관찰한 결과 사망 동물은 관찰되지 않았으므로 시료는 독성이 없는 것으로 판명되었다.
- 마우스를 3개 군(군당 10마리)으로 나누어 각 군에 에탄올을 2 mL/kg 용량으로 경구투여하고 30분이 지난 후에 물, 미발효액, 발효액을 경구투여(1 mL/kg)하여 각 군의 마우스를 locomotor activity cage(54 × 50 × 37(h) cm)에 넣고 활동성을 관찰하였다.
- 마우스를 3개 군(군당 10마리)으로 나누어 각 군에 에탄올을 2 mL/kg 용량으로 경구투여하고 30분이 지난 후에 물, 미발효액, 발효액을 경구투여(1 mL/kg)하여 각 군의 마우스를 locomotor activity cage(54 × 50 × 37(h) cm)에 넣고 활동성을 관찰하였다. 마우스의 활동성은 activity cage 내에서 마우스들이 움직이면서 일루미네이터에서 센서로 비추는 photobeam을 차단하는 빈도수를 10분간 합산하여 120분 동안 관찰하였다.
- 마우스의 활동성을 관찰하기 위하여 마우스를 3개 군(군당 10마리)으로 나누어 각 군에 에탄올을 2 mL/kg의 용량으로 경구투여하고 30분이 지난 후에 물, 발효액, 미발효액을 경구투여하여 각 군의 마우스(10마리)를 locomotor activity cage(54 × 50 × 37(h) cm)에 넣고 활동성을 관찰하였다.
- 본 연구에서는 숙취 해소에 효능이 있는 약용식물을 동의 보감 [21]에 근거하여 선별한 후 이들의 추출물로 숙취 해소 음료를 개발하여 마우스에 대한 숙취 해소 효능을 관찰하였다. 많은 경우에서 미생물에 의한 발효가 지표 물질들을 활성이 더 높은 물질로 대사시키므로 본 연구에서는 선별한 약용식물의 추출물을 균주(유산균, 효모, 납두균 함유)로 발효 시켜 발효액과 미발효액의 숙취 해소 효능을 비교하였다. 그러나 기대와는 달리 모든 실험에서 미발효액이 발효액보다더 높은 숙취 해소 효능을 갖는 것으로 관찰되었다.
- 미발효액과 발효액 시료의 분석은 HPLC(W2695; Waters, USA)로 실시하였다. 각 시제품을 Sep-Pak C18 Cartridges (Waters)에 통과시킨 후, 0.
- 0m/min)으로 작동하는 rota-rod의 회전축 상에 올려놓고 10분간 적응훈련을 시킨 후 본 실험에 사용하였다. 본 실험에 사용하는 알코올 용량을 정하기 위한 예비실험으로 50% 에탄올을 조제하여 용량을 달리 투여(absolute ethanol 기준 0~10 mL/kg)한 마우스의 running time을 rota-rod 상에서 관찰한 후 rota-rod test와 locomotor activity test에서 쓰일 알코올의 용량을 정하였다. 각 알코올 농도에서 2마리씩 총 20마리의 마우스를 사용하였다.
- 각 알코올 농도에서 2마리씩 총 20마리의 마우스를 사용하였다. 본 실험에서는 마우스를 3개군(군당 10마리)으로 나누어 각 군에 알코올(absolute ethanol 기준 2 mL/kg)을 경구투여한 후 30분 후에 미발효액, 발효액 또는 물을 경구투여(1 mL/kg)하고 30분 후에 rotarod test를 실시하였다.
- 분석 칼럼은 Bondapak C18 Column(4.6 × 250 mm; Waters)을 사용하였고 이동상으로는 acetonitrile과 증류수를 7:3으로 혼합하여 유속 1.0 mL/min 로 사용하여 추출액의 발효 전과 발효 후의 피크를 230 nm 와 280 nm에서 비교 관찰하였다.
- 시료의 안전성을 평가하기 위해 급성 독성 평가를 시행하였다. 약재를 마우스(군당 10마리)에 한 번 경구투여(500, 5,000, 15,000 mg/kg)하여 2주 동안 사망한 개체가 있는지 관찰하였다.
- 3차로 건강, 산사 등의 추출 농축액과 혼합하여 최종액을 제조한 후 균주(유산균, 효모, 납두균 함유)를 가하여 섭씨 40도에서 48시간 동안 발효시킨 혼합액을 물과 2:8의 비율로 혼합하였다. 시제품은 미발효액과 발효액으로 구분하여 제작되었으며 본 연구에서는 두 시제품의 생리학적 활성을 비교 측정하였다.
- 시료의 안전성을 평가하기 위해 급성 독성 평가를 시행하였다. 약재를 마우스(군당 10마리)에 한 번 경구투여(500, 5,000, 15,000 mg/kg)하여 2주 동안 사망한 개체가 있는지 관찰하였다.
- 약재는 동의보감 [21]을 근거로 하여 관련 효능이 있는 약재들을 선별하였다. 우선, 속 쓰림 제거에 좋은 별나무, 위장을 편안하게 하는 산사, 건강 등의 약재들과 원기 회복과 관련 있는 홍삼 등을 선별한 후 3단계의 단계적 추출 및 혼합과정을 거쳤다. 즉, 1차로 홍삼과 콩나물을 추출 농축하였고, 2차로 구기자, 갈근 등의 추출 농축액과 혼합하였다.
- 우선, 속 쓰림 제거에 좋은 별나무, 위장을 편안하게 하는 산사, 건강 등의 약재들과 원기 회복과 관련 있는 홍삼 등을 선별한 후 3단계의 단계적 추출 및 혼합과정을 거쳤다. 즉, 1차로 홍삼과 콩나물을 추출 농축하였고, 2차로 구기자, 갈근 등의 추출 농축액과 혼합하였다. 3차로 건강, 산사 등의 추출 농축액과 혼합하여 최종액을 제조한 후 균주(유산균, 효모, 납두균 함유)를 가하여 섭씨 40도에서 48시간 동안 발효시킨 혼합액을 물과 2:8의 비율로 혼합하였다.
- 측정된 흡광도를 aldehyde 표준곡선에 대입 하여 aldehyde의 농도(µmol)를 측정하였다.
- 표준곡선은 10 mM aldehyde 표준용액을 1,000, 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3, 0 µM로 희석하여 상기와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여 작성하였다.
- 행동 약리 실험으로 locomotor activity cage set(UGO BASILE, Italy)을 사용하여 마우스의 활동성을 관찰하였다. 마우스를 3개 군(군당 10마리)으로 나누어 각 군에 에탄올을 2 mL/kg 용량으로 경구투여하고 30분이 지난 후에 물, 미발효액, 발효액을 경구투여(1 mL/kg)하여 각 군의 마우스를 locomotor activity cage(54 × 50 × 37(h) cm)에 넣고 활동성을 관찰하였다.
- 행동 약리실험으로 rota-rod test를 통한 마우스의 균형감각을 평가하였다. 알코올 용량을 정하기 위한 예비실험으로 에탄올 용량과 running time의 상관관계를 관찰한 결과 에탄올 용량 의존적으로 running time이 짧아짐을 관찰할 수 있 었다(Fig.
대상 데이터
- 본 실험에 사용하는 알코올 용량을 정하기 위한 예비실험으로 50% 에탄올을 조제하여 용량을 달리 투여(absolute ethanol 기준 0~10 mL/kg)한 마우스의 running time을 rota-rod 상에서 관찰한 후 rota-rod test와 locomotor activity test에서 쓰일 알코올의 용량을 정하였다. 각 알코올 농도에서 2마리씩 총 20마리의 마우스를 사용하였다. 본 실험에서는 마우스를 3개군(군당 10마리)으로 나누어 각 군에 알코올(absolute ethanol 기준 2 mL/kg)을 경구투여한 후 30분 후에 미발효액, 발효액 또는 물을 경구투여(1 mL/kg)하고 30분 후에 rotarod test를 실시하였다.
- 실험동물은 생후 8주령 된 수컷 BALB/c mouse를 (주)오리엔트바이오로부터 구매하여 2주간 제주대학교 실험동물센터(온도, 22 ± 2℃; 습도, 50~55%; 명암주기, 12시간)에서 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 약재의 추출 및 발효는 (주)N3H바이오에서 실시하였다. 약재는 동의보감 [21]을 근거로 하여 관련 효능이 있는 약재들을 선별하였다. 우선, 속 쓰림 제거에 좋은 별나무, 위장을 편안하게 하는 산사, 건강 등의 약재들과 원기 회복과 관련 있는 홍삼 등을 선별한 후 3단계의 단계적 추출 및 혼합과정을 거쳤다.
- 약재의 추출 및 발효는 (주)N3H바이오에서 실시하였다. 약재는 동의보감 [21]을 근거로 하여 관련 효능이 있는 약재들을 선별하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 SPSS Statistics(ver. 17.0; SPSS, USA)를 사용하여 통계처리 하였으며, 모든 결과는 평균과 표준오차 (Mean ± SE)로 나타내었다.
- 0; SPSS, USA)를 사용하여 통계처리 하였으며, 모든 결과는 평균과 표준오차 (Mean ± SE)로 나타내었다. 실험군 간의 비교는 one-way ANOVA에 의하여 유의성이 인정되는 경우 Dunnett의 다중 비교검정을 통하여 실시하였다.
성능/효과
- 1, Table 1 and 2). 230 nm에서 관찰한 retention time 7.7 min의 경우 발효액의 피크가 미발효액보다 1.4배 증가함을 관찰할 수 있었으며, retention time 10.5 min의 경우 발효액의 피크가 미발효액보다 1.49배 증가함을 관찰할 수 있었다(Fig. 1A, Table 1). 280 nm에서도 상기와 유사한 결과를 관찰하였다(Fig.
- 급성 독성 평가는 약재를 마우스(군당 10마리)에 한 번 경구투여(500, 5,000, 15,000 mg/kg)하여 급성 독성을 평가하였다. 2주간 관찰한 결과 사망 동물은 관찰되지 않았으므로 시료는 독성이 없는 것으로 판명되었다.
- 알코올을 투여한 마우스를 대상으로 locomotor activity test를 실시한 결과 미발효액이 투여 후 40분 이후에 숙취 해소 효과가 있음을 관찰할 수 있었다. Locomotor activity test 직후즉, 약물 투여 120분 이후에 채혈한 혈액에서 분리한 혈청 중의 aldehyde 농도는 미발효액 투여군의 경우 aldehyde의 농도가 유의성 있게 감소하여 마우스의 활동성은 혈중 aldehyde의 농도에 반비례함을 알 수 있었다. 이상의 결과에서 본 실험에서 사용한 약용식물의 미발효액은 알코올을 투여한 마우스의 활동성을 투약 후 40분 이후에 지속해서 증가시켰으며, 이는 약물에 의한 혈중 aldehyde 농도의 감소에 기인하는 것으로 보인다.
- 많은 경우에서 미생물에 의한 발효가 지표 물질들을 활성이 더 높은 물질로 대사시키므로 본 연구에서는 선별한 약용식물의 추출물을 균주(유산균, 효모, 납두균 함유)로 발효 시켜 발효액과 미발효액의 숙취 해소 효능을 비교하였다. 그러나 기대와는 달리 모든 실험에서 미발효액이 발효액보다더 높은 숙취 해소 효능을 갖는 것으로 관찰되었다. 알코올을 투여한 마우스를 대상으로 locomotor activity test를 실시한 결과 미발효액이 투여 후 40분 이후에 숙취 해소 효과가 있음을 관찰할 수 있었다.
- 3). 따라서 미발효액 투여 후 60분 이후 마우스에서 숙취 해소 효과가 있음을 관찰할 수 있었다.
- 본 연구에서 투약 120분 이후에 관찰된 마우스의 혈중 aldehyde의 농도는 locomotor activity test에서 관찰된 마우스의 활동성과 거의 일치한 것으로 미루어 혈중 aldehyde 농도는 마우스의 활동 성에 직간접적으로 영향을 미치는 것으로 생각된다. 따라서 본 실험에서 사용한 약용식물의 미발효액은 알코올을 투여한 마우스의 혈중 aldehyde의 농도를 감소시킴으로써 활동성을 증가시키는 것으로 보인다.
- 1B, Table 2). 따라서 추출액은 발효 후에 특정 성분이 증가함을 관찰할 수 있었다.
- 또한 알코올 투여 후 물, 발효액, 미발효액 등의 투여가 rota-rod test 상에서 마우스의 운동성 회복 효과를 주는 것으로 생각된다. 본 연구에서 시행한 HPLC 분석의 경우 retention time 7.7 및 10.5분대에서 관찰된 주요 피크는 시료의 발효 후에 더욱 증가한 결과를 나타내었으나 마우스의 활동성 및 혈중 aldehyde의 농도는 미발효액과 비교하여 오히려 높은 값을 나타낸 것으로 미루어 이러한 피크는 숙취 해소와는 무관한 중간 대사물인 것으로 생각된다. 앞으로 발효 후 피크 범위가 더 낮아진 분획(retention time 3.
- 음주 후에 나타나는 숙취는 간에서 미처 대사되지 못한 acetaldehyde의 부작용에 기인하며 [14], 숙취 및 기억력 장애 등의 증상이 나타나는 것은 acetaldehyde가 소뇌, 대뇌 등을 자극하기 때문으로 알려졌다 [9]. 본 연구에서 투약 120분 이후에 관찰된 마우스의 혈중 aldehyde의 농도는 locomotor activity test에서 관찰된 마우스의 활동성과 거의 일치한 것으로 미루어 혈중 aldehyde 농도는 마우스의 활동 성에 직간접적으로 영향을 미치는 것으로 생각된다. 따라서 본 실험에서 사용한 약용식물의 미발효액은 알코올을 투여한 마우스의 혈중 aldehyde의 농도를 감소시킴으로써 활동성을 증가시키는 것으로 보인다.
- 05)을 관찰할 수 있었다. 상기의 결과에서 마우스의 활동성은 혈중 aldehyde의 농도에 반비례함을 알 수 있었다.
- 그러나 기대와는 달리 모든 실험에서 미발효액이 발효액보다더 높은 숙취 해소 효능을 갖는 것으로 관찰되었다. 알코올을 투여한 마우스를 대상으로 locomotor activity test를 실시한 결과 미발효액이 투여 후 40분 이후에 숙취 해소 효과가 있음을 관찰할 수 있었다. Locomotor activity test 직후즉, 약물 투여 120분 이후에 채혈한 혈액에서 분리한 혈청 중의 aldehyde 농도는 미발효액 투여군의 경우 aldehyde의 농도가 유의성 있게 감소하여 마우스의 활동성은 혈중 aldehyde의 농도에 반비례함을 알 수 있었다.
- 이는 에탄올 용량 2 mL/kg가 알코올에 의한 균형감각이 완전히 소실되지 않고 숙취효과를 관찰할 수 있는 농도 임을 알 수 있다. 이를 통하여 rota-rod test에서는 에탄올 용량 2 mL/kg과 발효액, 미발효액을 순서대로 30분 간격으로 경구투여하고 30분 후에 rota-rod test를 실시한 결과 군간 running time의 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았다 (Fig. 2B).
- Locomotor activity test 직후즉, 약물 투여 120분 이후에 채혈한 혈액에서 분리한 혈청 중의 aldehyde 농도는 미발효액 투여군의 경우 aldehyde의 농도가 유의성 있게 감소하여 마우스의 활동성은 혈중 aldehyde의 농도에 반비례함을 알 수 있었다. 이상의 결과에서 본 실험에서 사용한 약용식물의 미발효액은 알코올을 투여한 마우스의 활동성을 투약 후 40분 이후에 지속해서 증가시켰으며, 이는 약물에 의한 혈중 aldehyde 농도의 감소에 기인하는 것으로 보인다.
- 혈중 aldehyde 농도는 발효액 투여군(324 ± 32µM)과 물 투여군(345 ± 35 µM)에서 거의 유사한 값을 관찰하였으나 비발효액 투여군(232 ± 27 µM)의 경우 aldehyde의 농도가 유의성 있게 감소됨(p < 0.05)을 관찰할 수 있었다.
후속연구
- 본 연구에서 투약 30분 후에 실시한 rota-rod test의 결과는 발효액이 미발효액보다 다소 높은 값을 나타내었으나 이는 투약 후 즉시 실시한 locomotor activity test의 30분대에 해당 하는 시간대로 모든 군의 활동성이 낮은 시간대에서 관찰한 결과이기에 추후 다양한 시간대에서 측정하여 locomotor activity test 결과와 비교하는 실험이 필요하다. 또한 알코올 투여 후 물, 발효액, 미발효액 등의 투여가 rota-rod test 상에서 마우스의 운동성 회복 효과를 주는 것으로 생각된다.
- 5분대에서 관찰된 주요 피크는 시료의 발효 후에 더욱 증가한 결과를 나타내었으나 마우스의 활동성 및 혈중 aldehyde의 농도는 미발효액과 비교하여 오히려 높은 값을 나타낸 것으로 미루어 이러한 피크는 숙취 해소와는 무관한 중간 대사물인 것으로 생각된다. 앞으로 발효 후 피크 범위가 더 낮아진 분획(retention time 3.9, 6.8분)을 대상으로 숙취 해소 효과에 관한 연구가 시행되어야 할 것이다.
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