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문제 정의
- 만들어진 각각의 조다당 분획을 peritoneal macrophage에 처리하여 nitric oxide(NO), IL-6, IL-12등 면역력 증강 관련 지표 상승에 영향을 미치는 strain을 선별하고 이렇게 선발된 효모의 발효 조건을 달리하였을 때 지표 변화에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 또한 면역 활성이 가장 높았던 발효 조건의 술덧에서 분리한 조다당 시료의 구성당을 조사하여 유효 시료의 조성 특성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 4가지 효모 중 면역 활성에 더 나은 효과를 보이는 균주를 선발하여 발효온도(15°C, 20°C, 25°C, 30°C)에 따라 막걸리를 달리 제조하였다.
- 4종의 S. cerevisae 각각으로 발효된 술덧에서 ethanol 침전법으로 분리한 조다당 시료(CP-M)를 peritoneal macrophages에 저농도(10 μg/mL)와 고농도(100 μg/mL)로 처리하였을 때 NO 생성량을 통해 macrophage 활성화 정도를 확인하였다.
- 5시간 반응시켜 가수분해 후 1 mL의 1 M NH4OH 용액에 용해하여 10 mg NaBH4로 4시간 환원시켰다. Acetic acid를 적당량 가하여 잔존하는 NaBH4를 제거한 후 methanol을 가하며 반복 건조함으로써 과량으로 가해진 acetic acid를 제거하여 각 구성당에 상당하는 alditol로 전환하였다. 중성당의 구성을 알기 위해 각각의 alditiol을 1 mL acetic anhydride를 가하여 121°C에서 30분 동안 반응시켜 alditol acetate로 전환시켰으며, 이를 chloroform/H2O2상 용매계로 분리하여 추출하고, 추출물은 건조 후 소량의 acetone에 용해하여 GC 분석용 시료로 사용하였다.
- Cytokines 농도 측정: 배지로 희석시킨 막걸리 조다당 (CP-M)을 세포에 처리하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 상등액으로 분비된 cytokines IL-6, IL-12의 양을 제조사의 지침에 따라 ELISA kit(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였다(22).
- NO assay: 활성화된 대식세포가 분비하는 것으로 알려진 NO의 생성량을 측정하였다. NO의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite 양을 측정하였다.
- NO의 활성 정도는 ELISA 판독기(Infinite M200 Pro, Tecan, Männedorf, Switzerland)를 사용하여 540 nm 흡광도를 측정하였다(22).
- Peritoneal macrophage 세포 분리 배양: C57BL/6 mouse (male, 5 weeks, Hanlim Animal Research, Hwasung, Korea)의 복강에 5% thioglycollate(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 1 mL 주입하고, 72∼96시간 내에 유도된 macrophage를 PBS를 이용하여 회수하였다.
- S. cerevisae 113-4를 접종하여 15, 20, 25, 30°C 온도 조건에서 2일의 주모 발효기간 포함 총 7일간을 발효하여 술덧을 만들었다.
- S. cerevisae 113-4를 접종하여 25°C에서 10일간 각기 발효기간을 다르게 만든 막걸리 술덧 유래 조다당 시료 (CP-M)가 면역 활성 유도에 미치는 영향을 관찰하였다.
- 가용성 고형분 및 pH: 가용성 고형분 함량은 hand refractometer(Atago Pocket PAL-1, Atago Co. Ltd., Tokyo, Japan)로 측정하여 °Brix, %로 표시하였고 pH는 pH meter(Horiba, Kyoto, Japan)를 이용하여 측정하였다(23).
- Injection 온도 250°C, detector 온도 270°C, column 온도는 60°C에서 220°C까지 30°C/min, 220°C에서 250°C까지 8°C/min의 조건 하에서 실험하였다. 각 구성당의 mole%는 각 유도체의 peak 면적, 분자량 및 FID에 대한 molecular response factor를 각각 산출하여 계산하였다.
- 구성당 분석: 구성당 분석은 Jones와 Albersheim(27)의 방법을 일부 변형하여 사용하였다. 다당 시료를 2 M trifluroacetic acid(TFA) 중에서 121°C, 1.
- 분리한 용액에 2 M TFA를 가하여 100°C에서 5분간 반응시켜 aldonolactone으로 전환시켰다. 그 후 chloroform/ H2O2상 용매계로 분리하여 추출하고 건조하여 GC 분석 시료로 사용하였다. GC column은 SP-2380 capillary column(0.
- 4가지 효모 중 면역 활성에 더 나은 효과를 보이는 균주를 선발하여 발효온도(15°C, 20°C, 25°C, 30°C)에 따라 막걸리를 달리 제조하였다. 마지막으로 막걸리가 발효기간별로 면역 활성 효과에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 밑술을 제조한 뒤 덧술 발효기간을 0일, 1일, 3일, 5일, 7일, 10일로 차이를 두어 막걸리를 제조 하였다.
- 막걸리 술덧 제조: 발효 조건이 막걸리 유래 다당의 면역 자극 활성에 미치는 효과를 알아보기 위하여 S. cerevisae strain별, 발효온도, 발효기간을 달리하여 막걸리를 제조하였다. 막걸리 기본 제조 방법은 Table 1과 같다.
- cerevisae)를 접종하여 발효시킨 막걸리 술덧으로부터 조다당 분획을 분리하여 동결건조 분말을 얻었다. 만들어진 각각의 조다당 분획을 peritoneal macrophage에 처리하여 nitric oxide(NO), IL-6, IL-12등 면역력 증강 관련 지표 상승에 영향을 미치는 strain을 선별하고 이렇게 선발된 효모의 발효 조건을 달리하였을 때 지표 변화에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 또한 면역 활성이 가장 높았던 발효 조건의 술덧에서 분리한 조다당 시료의 구성당을 조사하여 유효 시료의 조성 특성을 확인하고자 하였다.
- 본 연구에서는 효모(S. cerevisae)를 접종하여 발효시킨 막걸리 술덧으로부터 조다당 분획을 분리하여 동결건조 분말을 얻었다. 만들어진 각각의 조다당 분획을 peritoneal macrophage에 처리하여 nitric oxide(NO), IL-6, IL-12등 면역력 증강 관련 지표 상승에 영향을 미치는 strain을 선별하고 이렇게 선발된 효모의 발효 조건을 달리하였을 때 지표 변화에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
- 알코올 함량: 알코올 함량은 시료를 0.45 μm syringe filter(Xpertek, Rivonia, Republic of South Africa)로 여과 하여 GC(6890N, Hewlett Packard Co., Palo Alto, CA, USA)로 분석하였다.
- 여기에 ethanol 침전물을 분리해 만든 CP-M을 저농도(50 μg/mL)와 고농도(100 μg/mL)의 두 가지 농도로 peritoneal macrophages에 처리하였을 때 면역 세포 활성화로 생성된 세포 배양 상등액 중의 NO 농도를 측정하였다.
- 여기에 진한 황산 3 mL를 가하고 85°C water bath에서 15분간 발색시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정 하여 검량선으로부터 구해진 β-D-galacturonic acid(SigmaAldrich Co.)를 표준물질로 하여 함량을 계산하였다.
- 45 μm membrane filter로여과하여 여액을 각각 1 mL씩 취하여 5% phenol 1 mL에잘 혼합시켰다. 여기에 황산 5 mL를 첨가한 후 30분 반응시키고 490 nm에서 흡광도를 측정하여 검량선으로부터 구해진 glucose의 함량으로 총당 함량을 계산하였다.
- cerevisae 113-4효모를 선별하였다. 이후의 연구는 S. cerevisae 113-4를 접종한 CP-M에 대하여 실시하였다.
- 중성당의 구성을 알기 위해 각각의 alditiol을 1 mL acetic anhydride를 가하여 121°C에서 30분 동안 반응시켜 alditol acetate로 전환시켰으며, 이를 chloroform/H2O2상 용매계로 분리하여 추출하고, 추출물은 건조 후 소량의 acetone에 용해하여 GC 분석용 시료로 사용하였다.
- 최종 1,500 g 중량으로 멥쌀(Odae-mi, Choerwon, Korea), 발효제인 진주곡자(SP300, Jinju, Korea), 효모(0.02%), 물을 넣고 25°C에서 2일 동안 발효하여 밑술을 제조한 다음 멥쌀과 물을 추가로 첨가하여 덧술을 제조한 후 25°C에서 5일 동안 발효하여 막걸리를 제조하였다.
- 침전물을 소량의 증류수에 용해하여 Spectra/Por 투석막(MWCO: 6,000∼8,000, Spectrum Medical Industries Inc., Laguna Hills, CA, USA)을 이용 하여 2∼3일간 투석을 처리한 것을 동결건조(FD5508, Ilshin Lab Co. Ltd., Suwon, Korea) 하여 조다당 시료(CP-M, crude polysaccharides from Makgeolli mash)를 얻었다.
대상 데이터
- Column은 DB-ALC2(30 m×0.53 mm, 2 μm film thickness, J & W Scientific, Folsom, CA, USA)를 사용하였고, oven 온도 70°C(isothermal), inlet 온도 200°C, detector FID 250°C의 분석조건에서 carrier gas는 helium을 사용하였다.
- Macrophage로부터 생성된 NO 농도 및 cytokine 생성능을 고려했을 때 비교 대상이 된 4가지 효모 중 더 우세한 면역 활성화 효능이 기대되는 균주로 S. cerevisae 113-4효모를 선별하였다. 이후의 연구는 S.
- 5×105 cell/well로 조정하여 96-well plate에 배양하였다. 배지는 RPMI 1640에 10% (v/v) fetal bovine serum(FBS, Gibco BRL Co.)과 1%(v/v) penicillin-streptomycin을 가한 배지를 사용하였다(22).
- 본 연구에 사용한 4종의 효모 89-1-1, 98-2, 268-3, 113-4는 한국식품연구원 우리술 연구팀에서 분리･보관 중인 S. cerevisae strain을 Potato Dextrose Agar(PDA, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에 배양하여 사용하였다.
- 전통주 술덧은 주모, 입국, 곡자 등과 덧밥을 담금 급수에 첨가한 전체 물료(物e)를 말하는 것으로 우리의 전통주 제조 과정에서는 이것을 걸러 약주와 탁주 등을 만든다(29). 앞서 결과를 제시한 면역 활성 평가실험에는 S. cerevisae 113-4 활용 막걸리 술덧으로부터 조다당 시료(CP-M)를 만들어 사용하였다. 해당 시료에 대한 주요 성분 함량과 구성당 조성을 분석한 결과는 Table 3에 나타난 바와 같이 중성당 함량 78.
데이터처리
- 연구 결과 얻어진 자료는 SPSS(ver 18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 기술 통계치(mean, SD)를 산출하였고, 대조군(Control)과 양성 대조군(LPS) 및 시료 처리군의 평균의 차이는 독립표본 t-test를 이용하여 유의 성을 검증하였다(P<0.05, P<0.01).
이론/모형
- NO assay: 활성화된 대식세포가 분비하는 것으로 알려진 NO의 생성량을 측정하였다. NO의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite 양을 측정하였다. 100 μL의 세포배양 상층액을 취하여 동량의 Griess reagent(SigmaAldrich Co.
- 단백질 함량 측정은 Bradford method로 측정하였으며 표준물질로는 bovine serum albumin(Sigma-Aldrich Co.) 을 사용하였다(26).
- 산성당 함량은 carbazole-sulfuric acid법으로 측정하였다(25). 1%(w/v) CP-M 용액을 각각 0.
- 일반성분 분석 방법: 총당 함량은 phenol-sulfuric acid 법으로 측정하였다(24). 즉 test tube에 증류수로 희석한 1%(w/v) CP-M 시료용액을 0.
성능/효과
- Fig. 1에 나타난 바와 같이 CP-M 대신 멸균 증류수를 처리한 대조구는 NO 생성량이 9.2 μM이었으나 저농도 시료 처리구에서의 NO 생성량은 268-3 효모로 제조한 CP-M 처리구가 최저인 16.7 μM, 113-4 효모 제조 CP-M 처리구는 최고인 33.3 μM로 나타났다.
- Peritoneal macrophages에 발효기간을 달리한 CP-M 시료 100 μg/mL씩 처리하여 생성된 NO 농도는 술덧을 만든 0일째 시료 19.7 μM, 3일째 시료 27.8 μM, 5일째 시료 44.2μM, 10일째 시료 12.7 μM로 5일째 시료의 macrophage 활성화 효능이 가장 우수하게 나타났다(Fig. 5).
- 그 밖에도 30°C에서 발효한 술덧 시료는 저농도를 처리 했을 때 IL-6의 농도가 211.0 pg/mL로 무처리 대조구와 차이가 없었으나 고농도를 처리했을 때는 488.2 pg/mL로 CP-M 처리 농도가 2배 증가하는 동안 IL-6의 농도가 2.3배 증가하여, 면역세포에 처리한 시료의 농도가 50 μg/mL 이상의 높은 농도일 때 IL-6 생산을 유도하는 특성을 확인하였다.
- 미생물의 산 생성에 의해 조성된 산성의 환경은 발효 중인 막걸리 내의 성분 변화는 물론 효모, 유산균, 진균 등 자체 eco-system에도 영향을 미치므로 알코올 생성, 휘발성 물질 생성 등에 의미 있는 시기라고할 수 있다. 그러나 본 연구의 결과에서는 이 시기는 주류로서 특성뿐 아니라 막걸리의 면역관련 기능성에도 영향을 미침을 확인할 수 있었다.
- 무처리 대조구의 IL-6 농도는 205.5 pg/mL였으나 25°C에서 발효한 CP-M 은 저농도 처리했을 때 1,114.4 pg/mL, 고농도 처리했을때 1,064.5 pg/mL로 무처리구에 비해 최고 5.4배 증가하였다.
- 본 연구 결과에서 다른 온도에 비해 25°C에서 발효한 술덧 시료의 면역 활성 유도 효능이 컸던 것은 원재료나 기타 잡균에 의한 영향보다는 기능성 발현을 위해 접종한 효모의 생물학적 또는 생화학적 활성이 최대화되는 온도와 상관성이 있을 것으로 사료된다.
- 그러나 전통주인 막걸리의 경우 아직 이에 대한 구체적인 규명이 미미하다. 본 연구에서는 막걸리의 우세 균주인 효모 선별과 그 발효 조건에 따라 술덧의 면역증강 활성 발현에 영향을 미칠 수 있음을 확인하였고, 원심분리 후 얻어진 술덧 유래 조다당 시료는 mannose 함량이 높은 효모 유래의 다당 분획일 것으로 추정하였다. 우리나라는 예로부터 전통주를 담그기 위한 다양한 발효법을 전승하고 있고, 발효에 관여하는 균총 또한 다양하다.
- 세포 배양상등액 중 IL-6의 농도는 0∼10일간 발효시킨 CP-M 처리 구에서 2,135.1∼6,619.8 pg/mL로 나타나 모두 대조구에 비해 농도가 높았다(Fig. 6-A).
- Lee 등(6)과 Lee 등(11)은 막걸리 발효에 관여하는 효모의 다양성과 다양한 효모에 의해 생성되는 막걸리의 향미적 특성 및 ethanol 생산성 등에 대해 보고한 바 있다. 앞선 연구들이 술을 만들기 위한 최적 효모 strain과 그 조건에 대해 연구를 한 것이며, 본 연구는 다른 첨가물이 없어도 알코올을 생성하는 효모 strain에 따라 면역세포를 자극하는 활성이 다르게 나타난다는 것을 확인하였다.
- 이 연구에서 Saccharomyces sp의 경우 생성 다당의 구성당 중 가장 함량이 높았던 mannose의 구성 비율은 84∼93%, glucose는 7∼16%라고 하였다.
- 중성당의 구성당 비율을 살펴보면 mannose(47.8 mole%)의 함량이 매우 높고 glucose(29.6 mole%)와 galactose (12.7 mole%) 순으로 높은 비율을 차지하고 있었는데, 이들 3종의 다당류의 합은 전체 구성당의 90.1%를 차지했다 (Table 3). 이러한 술덧의 당 구성은 원료 또는 발효과정중 미생물 증식과 관련하여 유래한 것일 수 있다.
- cerevisae 113-4 활용 막걸리 술덧으로부터 조다당 시료(CP-M)를 만들어 사용하였다. 해당 시료에 대한 주요 성분 함량과 구성당 조성을 분석한 결과는 Table 3에 나타난 바와 같이 중성당 함량 78.6%, 산성다당 11.6 %, 단백질 9.8%로 다당 성분의 비율이 90.2%임을 확인하였다.
후속연구
- S. cerevisae 113-4 효모로 발효된 술덧에서 분리한 조다당 시료는 적절한 온도(25°C) 와 발효기간(5일)을 거쳐 제조하였을 때 macrophage의 활성화 및 cytokines의 생산성을 높이는 데 관여함으로 이후 세포성 면역(cell-mediated immunity) 체계 활성화에 긍정적인 영향을 미칠 것으로 기대할 수 있다.
- 막걸리는 곡류를 기질로 하여 만들기 때문에 곡류에서 유래한 당질, 단백질, 아미노산 등의 함량이 높은 독특한 영양적 특성을 가지고 있다. 그렇기 때문에 포도주의 기능성이 발효 기질이 함유한 polyphenols에서 오는 반면 막걸리의 기능성은 충분한 영양원을 기반으로 증식한 미생물 균체 또는 그 대사산물에 의해 부가되므로 발효주를 개발할 때 균의 종류에 따라 맛과 향은 물론 기능성까지도 고려한 소재 개발이 가능할 것으로 여겨진다.
- 우리나라는 예로부터 전통주를 담그기 위한 다양한 발효법을 전승하고 있고, 발효에 관여하는 균총 또한 다양하다. 이를 바탕으로 기능에 맞는 균주를 선별하고 발효 공정을 개발한다면 와인에 뒤지지 않는 기능성을 내세울 수 있을 뿐 아니라 더 나아가 기능성 소재 개발까지도 가능할 것이라 여겨진다.
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