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문제 정의
- 본 연구는 둥굴레속 식물종간 외부 형태적 특성 비교는 물론, 엽록체 DNA 구간 내 바코드 후보 유전자인 rpoC1, rpoB2, matK, psbA-trnH 각 4개의 구간으로부터 발견된 SNPs 다형성을 분석함으로써 분자생물학적 측면에서의 둥굴레속 식물의 종 판별법을 모색하고자 수행되었다.
제안 방법
- 추출된 DNA는 Multiskan GO UV/Vis microplate spectrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 농도 및 순도를 확인하였으며 각각의 시료를 20 ng/㎕로 정량하여 PCR 반응에 사용하였다. PCR 분석을 위해 엽록체 DNA 구간인 rpoC1, rpoB2, matK, psbA-trnH 의 서열 내에서 primer를 제작하여 각각 사용하였으며, PCR 증폭은 40 ng genomic DNA와 forward 및 reverse primer 10 pmol, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 2.0 mMMgCl2, 2 unit Taq-DNA polymerase와 함께 총 반응액을 40 ㎕로 하여 Thermo cycler (PTC-200 DNA Engine, Bio-Rad Co., Hercules, CA, USA)에서 각 primer 조건별로 수행하였다 (Table 2). PCR 증폭은 결과의 신뢰도를 높이기 위하여 각 시료 당 2회 씩 반복하였다.
- , Hercules, CA, USA)에서 각 primer 조건별로 수행하였다 (Table 2). PCR 증폭은 결과의 신뢰도를 높이기 위하여 각 시료 당 2회 씩 반복하였다.
- 2). 각 PCR 산물은 정제하여 염기서열분석 및 정렬 후, 각각 432 bp, 463 bp, 811 bp, 563 bp의 염기서열에 대한 SNP 분석을 수행하였다. 또한 phylogenetic tree 내에서 발생한 분기점에 대한 Bootstrap value를 참고하여 종간 차이를 분석하였다.
- 1). 그러나 다양한 형태로 가공유통되는 뿌리줄기의 경우 판별에 어려움이 있어 보다 명확한 구분을 위해 cpDNA 구간의 염기서열분석을 수행하였다. 실험에 이용된 4개의 cpDNA 구간 중 rpoC1, rpoB2, matK 구간에서 공통적으로 층층둥굴레 및 층층갈고리둥굴레와 구별되는 SNP가 확인되었으며, Neighbor-Joining tree 에서도 이 그룹이 독립적으로 분지된 것으로 보아 계통적 분류가 선행된 형태학적 연구결과와 일치하는 것으로 확인되었다 (Table 3).
- 둥굴레속 식물체의 엽록체 DNA를 추출하기 위해 식물체의 잎으로부터 HiYield™ Genomic DNA Mini Kit (RBC, Inc., Taipei, Taiwan)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 처리하였다.
- 둥굴레속 식물체의 외부 형태적 분석을 위해 수집지역별로 3개체씩 선별하여 종간의 형태적 차이를 비교하였다. 이를 위하여 엽장 및 엽폭, 장폭비를 측정하였으며, 엽연 (葉緣), 엽선 (葉先), 엽맥 (葉脈), 근경 (根莖) 등 각 식물종의 형태적 특성을 비교하였다.
- 각 PCR 산물은 정제하여 염기서열분석 및 정렬 후, 각각 432 bp, 463 bp, 811 bp, 563 bp의 염기서열에 대한 SNP 분석을 수행하였다. 또한 phylogenetic tree 내에서 발생한 분기점에 대한 Bootstrap value를 참고하여 종간 차이를 분석하였다.
- 본 연구의 공시재료인 둥굴레속 7종 식물자원은 농촌진흥청 농업유전자원센터 성정숙 박사의 도움으로 종간 형태적 비교를 수행하였다. 한약재 황정으로 사용되는 진황정 및 층층갈고리둥굴레의 경우 타종들과 육안으로 일부 구별이 가능하였다 (Fig.
- 둥굴레속 식물체의 외부 형태적 분석을 위해 수집지역별로 3개체씩 선별하여 종간의 형태적 차이를 비교하였다. 이를 위하여 엽장 및 엽폭, 장폭비를 측정하였으며, 엽연 (葉緣), 엽선 (葉先), 엽맥 (葉脈), 근경 (根莖) 등 각 식물종의 형태적 특성을 비교하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 정제 후 ㈜제노텍 (Genotech Inc., Daejeon, Korea)에 의뢰하여 ABI Prism 3730xl DNA sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)로 염기서열을 분석하였다. 또한 본 연구에 사용된 둥굴레의 종간 염기서열 차이 비교를 위해 NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA)에 등록된 동일 종 또는 실험에 제외된 총 13종을 선정하여 적용하였다.
- , Taipei, Taiwan)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 처리하였다. 추출된 DNA는 Multiskan GO UV/Vis microplate spectrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 농도 및 순도를 확인하였으며 각각의 시료를 20 ng/㎕로 정량하여 PCR 반응에 사용하였다. PCR 분석을 위해 엽록체 DNA 구간인 rpoC1, rpoB2, matK, psbA-trnH 의 서열 내에서 primer를 제작하여 각각 사용하였으며, PCR 증폭은 40 ng genomic DNA와 forward 및 reverse primer 10 pmol, 10 mM Tris-HCl (pH 8.
대상 데이터
- falcatum) 등 총 7종 12점의 식물자원을 공시재료로 사용하였으며, 공시재료의 분류학적 구분은 농촌진흥청 농업유전자원센터에 의뢰하였다. 또한 둥굴레와 형태적으로 유사한 애기나리속 윤판나물 (Disporum sessile) 1점과 서울 경동시장에서 구입한 가공되지 않은 둥굴레속 한약재 옥죽 1점을 둥굴레 생체 시료들과 비교하고자 사용하였다 (Table 1).
- , Daejeon, Korea)에 의뢰하여 ABI Prism 3730xl DNA sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)로 염기서열을 분석하였다. 또한 본 연구에 사용된 둥굴레의 종간 염기서열 차이 비교를 위해 NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA)에 등록된 동일 종 또는 실험에 제외된 총 13종을 선정하여 적용하였다. 각 시료의 염기서열은 BioEdit version 7.
- 본 연구를 위해 일산 소재 동국대학교 실험농장에서 보유증식 중인 둥굴레 (Polygonatum odoratum var. pluriflorum), 무늬둥굴레 (P. odoratum var. pluriflorum f. variegatum)와 포항기청산식물원, 충북농업기술원, 농촌진흥청 국립원예특작 과학원 인삼특작부에서 분양받은 각시둥굴레 (P. humile), 용둥굴레 (P. involucratum), 층층둥굴레 (P. stenophyllum), 층층 갈고리둥굴레 (P. sibiricum), 진황정 (P. falcatum) 등 총 7종 12점의 식물자원을 공시재료로 사용하였으며, 공시재료의 분류학적 구분은 농촌진흥청 농업유전자원센터에 의뢰하였다. 또한 둥굴레와 형태적으로 유사한 애기나리속 윤판나물 (Disporum sessile) 1점과 서울 경동시장에서 구입한 가공되지 않은 둥굴레속 한약재 옥죽 1점을 둥굴레 생체 시료들과 비교하고자 사용하였다 (Table 1).
이론/모형
- 또한 본 연구에 사용된 둥굴레의 종간 염기서열 차이 비교를 위해 NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA)에 등록된 동일 종 또는 실험에 제외된 총 13종을 선정하여 적용하였다. 각 시료의 염기서열은 BioEdit version 7.2.5 프로그램 (http://bioedit.software.informer.com)의 ClustalW multiple alignment로 정렬한 후 MEGA6 (molecular evolutionary genetics analysis version 6.0) (Tamura et al., 2004)를 이용하여 Neighbor-Joining (NJ) 방법으로 (Saitou and Nei, 1987) 분석하여 phylogenetic tree를 작성하였으며, 계통수에 대한 지지도는 Bootstrap 값을 1000회 반복하여 평가하였다 (Felsenstein, 1985).
성능/효과
- 7종의 둥굴레속 식물의 엽록체 DNA로부터 rpoC1, rpoB2, matK, psbA-trnH 구간을 PCR 증폭한 결과, rpoC1에서는 약 550 ~ 600 bp, rpoB2에서는 약 550 ~ 600 bp, matK에서는 약 900 ~ 950 bp, psbA-trnH에서는 약 650 ~ 700 bp의 범위에서 PCR 산물이 확인되었다 (Fig. 2). 각 PCR 산물은 정제하여 염기서열분석 및 정렬 후, 각각 432 bp, 463 bp, 811 bp, 563 bp의 염기서열에 대한 SNP 분석을 수행하였다.
- KC704705)와 일치하였으며, 포항과 청주에서 분양받은 두 진황정 간에도 서로 다른 위치에서 SNP가 1개씩 확인되어 종내 SNP 차이를 확인하였다. Bootstrap 분석 결과, 층층둥굴레와 층층갈고리둥굴레가 95%의 높은 bootstrap 지지도로 동속타종과 구분되어 matK 구간이 층층둥굴레집단을 판별하는 기준이 될 가능성을 보여주었다. 또한 한약재 옥죽이 Neighbor-Joining tree 상에서 층층둥굴레 및 층층갈고리둥굴레 집단에 속하는 것이 확인됨에 따라 황정과의 혼용가능성을 보여주고 있다 (Fig.
- GQ435902) 사이에는 1개의 SNP 차이가 확인되었다 (data not shown). Bootstrap을 분석한 결과, 윤판나물과 둥굴레속은 100%의 bootstrap value로 자매군 (Sister group)으로서 명확하게 분지되었다 (Fig. 3). 둥굴레속 내에서는 층층둥굴레와 층층갈고리둥굴레가 하나의 집단으로 구분되었으며, 이때의 bootstrap 값은 62%로 나타났다.
- matK 구간 내 염기서열에서는 7개의 SNP가 확인되었으며 (data not shown), 층층둥굴레와 층층갈고리둥굴레의 서열에는 3개의 SNP가 존재하여 동속타종과 구별되었다. 포항기청산식물원 둥굴레의 matK 구간 내 염기서열은 용둥굴레 (P.
- lasianthum)의 서열과도 동일하였다. 그러나 동일종인 일산 동국대학교실험 농장 보유 개체의 서열은 NCBI에 등록된 둥굴레 (Genbank accession no. KC704705)와 일치하였으며, 포항과 청주에서 분양받은 두 진황정 간에도 서로 다른 위치에서 SNP가 1개씩 확인되어 종내 SNP 차이를 확인하였다. Bootstrap 분석 결과, 층층둥굴레와 층층갈고리둥굴레가 95%의 높은 bootstrap 지지도로 동속타종과 구분되어 matK 구간이 층층둥굴레집단을 판별하는 기준이 될 가능성을 보여주었다.
- 본 연구결과에서 엽록체 DNA를 대상으로 한 barcoding 분석은 둥굴레속 식물체 판별에 유용하며, 특히 종판별에서의 primer 단독 이용의 한계점이 여러 primer의 조합으로 상호보완 됨으로써 비교적 정확한 결과가 도출되는 것을 확인하였다. 또한 본 연구 결과를 둥굴레속 기원 한약재 판별마커 개발뿐만 아니라 향후 기타 약용식물자원의 표준화와 이들을 원료로 하는 건강기능식품 및 한약재의 품질개선을 위한 기초자료로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 상대적으로 종간 차이가 적었던 rpoB2 구간을 rpoC1과 조합한 결과, rpoB2에서 구별되지 않았던 각시둥굴레의 종간 구분이 확인되었으며 (Fig. 7A, B), 이에 matK 구간을 추가 조합한 결과를 바탕으로 작성된 phylogenetic tree에서는 matK 단독 이용 시 구분되지 않았던 각시둥굴레와 충북농업기술원 분양 진황정 사이의 종간 차이가 확인되었다 (Fig. 7C).
- 엽록체 DNA의 non-coding region인 psbA-trnH spacer에서는 둥굴레속의 종간 차이를 나타내는 2개의 SNP가 확인되었고, 층층둥굴레와 층층갈고리둥굴레 서열에서는 74개의 연속적 gap과 SNP 1개가 발견되었으며, 윤판나물의 서열에서는 각각 311개와 5개의 연속적 gap이 발견되어 둥굴레속 식물종과 확연히 구별되었다 (data not shown). 분지양상은 둥굴레속이 애기나리속인 윤판나물과 자매군으로서 100%의 bootstrap value로 분지되었고, 둥굴레속 내에서는 포항기청산식물원 분양 둥굴레가 용둥굴레, 왕둥굴레, 선둥굴레, 죽대와 동일 집단으로 분지되어 일산 동국대실험농장 보유 둥굴레 개체와 다른 집단으로 분류되었다 (Fig. 6). 한편, rpoC1, rpoB2, matK 세 구간에서 비교적 뚜렷하게 구분되었던 층층둥굴레와 층층갈고리둥굴레가 다른 종으로부터 구분되지 않아 이들을 위한 판별 마커로 이용하기는 어려울 것으로 사료된다.
- 엽서는 층층둥굴레와 층층갈고리둥굴레의 경우, 3개에서 8개의 잎이 윤생하며 이를 제외한 나머지 종은 호생하는 것으로 확인되었다. 뿌리줄기의 직경은 층층갈고리둥굴레가 가장 굵었으며, 각시둥굴레가 가장 가늘어 타종과 뚜렷한 차이를 보였다. 그러나 뿌리줄기가 한약재로서 시중에 유통될 때에는 다양한 형태로 가공되고 있으므로 외부 형태적 특성 비교에 따른 명확한 판별에는 한계가 있을 것으로 사료된다.
- 그러나 다양한 형태로 가공유통되는 뿌리줄기의 경우 판별에 어려움이 있어 보다 명확한 구분을 위해 cpDNA 구간의 염기서열분석을 수행하였다. 실험에 이용된 4개의 cpDNA 구간 중 rpoC1, rpoB2, matK 구간에서 공통적으로 층층둥굴레 및 층층갈고리둥굴레와 구별되는 SNP가 확인되었으며, Neighbor-Joining tree 에서도 이 그룹이 독립적으로 분지된 것으로 보아 계통적 분류가 선행된 형태학적 연구결과와 일치하는 것으로 확인되었다 (Table 3). 따라서 rpoC1, rpoB2, matK 구간이 둥굴레속으로부터 층층둥굴레 및 층층갈고리둥굴레를 판별하기 위한 바코드 유전자로 사용 가능할 것이라 사료된다.
- 엽록체 DNA의 coding region인 rpoC1 구간에서 확인된 SNP는 총 25개로 각시둥굴레에서 1개, 둥굴레속과 동일한 백합과에 속하는 애기나리속인 윤판나물에서 23개의 SNP가 발견되었으며, 윤판나물과 대만윤판나물 (D. cantoniense, Genbank accession no. GQ435902) 사이에는 1개의 SNP 차이가 확인되었다 (data not shown). Bootstrap을 분석한 결과, 윤판나물과 둥굴레속은 100%의 bootstrap value로 자매군 (Sister group)으로서 명확하게 분지되었다 (Fig.
- 엽록체 DNA의 non-coding region인 psbA-trnH spacer에서는 둥굴레속의 종간 차이를 나타내는 2개의 SNP가 확인되었고, 층층둥굴레와 층층갈고리둥굴레 서열에서는 74개의 연속적 gap과 SNP 1개가 발견되었으며, 윤판나물의 서열에서는 각각 311개와 5개의 연속적 gap이 발견되어 둥굴레속 식물종과 확연히 구별되었다 (data not shown). 분지양상은 둥굴레속이 애기나리속인 윤판나물과 자매군으로서 100%의 bootstrap value로 분지되었고, 둥굴레속 내에서는 포항기청산식물원 분양 둥굴레가 용둥굴레, 왕둥굴레, 선둥굴레, 죽대와 동일 집단으로 분지되어 일산 동국대실험농장 보유 둥굴레 개체와 다른 집단으로 분류되었다 (Fig.
- 1 및 Table 3와 같다. 엽장은 층층갈고리둥굴레가 다른 종들에 비해 길었으며 장폭비는 층층둥굴레와 함께 약 6:1로 선형의 엽형인 것을 확인하였다 (Fig. 1D, E). 한편 진황정을 포함한 타 둥굴레 속 식물체들의 엽형은 난형 (Fig.
- rpoB2 구간에서 뚜렷하게 확인된 SNP는 총 1개였다. 이 부위에 의하여 층층둥굴레와 층층갈고리둥굴레가 하나의 그룹으로 묶여 다른 둥굴레속 식물 종들과 구별되었으며, 이때의 bootstrap 지지도는 65%로 나타났다 (Fig. 4). 한편, 한약재 옥죽은 층층둥굴레 및 층층갈고리둥굴레와 같은 집단 내에 있어, 대한민국약전 기준에 따라 본 실험에 이용된 한약재가 황정이거나 혼용되었을 가능성이 있는 것으로 생각된다.
- matK 구간 내 염기서열에서는 7개의 SNP가 확인되었으며 (data not shown), 층층둥굴레와 층층갈고리둥굴레의 서열에는 3개의 SNP가 존재하여 동속타종과 구별되었다. 포항기청산식물원 둥굴레의 matK 구간 내 염기서열은 용둥굴레 (P. involucratum)와 동일하였고, NCBI에 등록된 선둥굴레 (P. grandicaule), 왕둥굴레 (P. robustum), 죽대 (P. lasianthum)의 서열과도 동일하였다. 그러나 동일종인 일산 동국대학교실험 농장 보유 개체의 서열은 NCBI에 등록된 둥굴레 (Genbank accession no.
- 1D, E). 한편 진황정을 포함한 타 둥굴레 속 식물체들의 엽형은 난형 (Fig. 1C) 또는 장타원형인 것으로 확인되어 (Fig. 1A, B, F, G), 층층둥굴레 및 층층갈고리둥굴레의 잎은 타 둥굴레 식물 종들과 뚜렷하게 구별되었다. 엽연은 둥굴레속 전체가 거치가 없이 밋밋하였으며, 엽맥은 평행맥이었다 (Table 3).
- 한편, psbA-trnH를 제외한 나머지 세 개 구간을 조합한 결과에서 단일 primer 분석 시 차이를 보이지 않던 각시둥굴레가 두 구간 이상의 상호조합 시 타종과 구분되었으며, 특히 rpoB2, rpoC1, matK 세 구간을 조합한 경우에는 각시둥굴레와 충북농업기술원 분양 진황정의 종간 차이가 확인되었다 (Fig. 7).
후속연구
- 뿌리줄기의 직경은 층층갈고리둥굴레가 가장 굵었으며, 각시둥굴레가 가장 가늘어 타종과 뚜렷한 차이를 보였다. 그러나 뿌리줄기가 한약재로서 시중에 유통될 때에는 다양한 형태로 가공되고 있으므로 외부 형태적 특성 비교에 따른 명확한 판별에는 한계가 있을 것으로 사료된다.
- 실험에 이용된 4개의 cpDNA 구간 중 rpoC1, rpoB2, matK 구간에서 공통적으로 층층둥굴레 및 층층갈고리둥굴레와 구별되는 SNP가 확인되었으며, Neighbor-Joining tree 에서도 이 그룹이 독립적으로 분지된 것으로 보아 계통적 분류가 선행된 형태학적 연구결과와 일치하는 것으로 확인되었다 (Table 3). 따라서 rpoC1, rpoB2, matK 구간이 둥굴레속으로부터 층층둥굴레 및 층층갈고리둥굴레를 판별하기 위한 바코드 유전자로 사용 가능할 것이라 사료된다. 또한 이들 구간에서 층층둥굴레와 층층갈고리 둥굴레가 한 집단에 속함에 따라 층층둥굴레의 근경이 한약재 황정에 포함되는 것이 타당하다는 연구 결과를 뒷받침해준다 (An et al.
- , 2011). 따라서 이 기술은 분류기준이 명확하지 않은 둥굴레속 식물자원의 종판별은 물론 이들의 가공 약재인 옥죽과 황정의 원재료 식물 판별에 유용할 것으로 판단된다.
- 본 연구결과에서 엽록체 DNA를 대상으로 한 barcoding 분석은 둥굴레속 식물체 판별에 유용하며, 특히 종판별에서의 primer 단독 이용의 한계점이 여러 primer의 조합으로 상호보완 됨으로써 비교적 정확한 결과가 도출되는 것을 확인하였다. 또한 본 연구 결과를 둥굴레속 기원 한약재 판별마커 개발뿐만 아니라 향후 기타 약용식물자원의 표준화와 이들을 원료로 하는 건강기능식품 및 한약재의 품질개선을 위한 기초자료로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
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