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문제 정의
- 단회 실험만의 결과로서 반복 실험을 통해 재현성을 확보하지 못했으며, 또한 지방산 산화도, ATP 생산량, 미토콘드리아의 양 및 AMPK와 PGC1α와 연관된 효소인 SIRT1, ACC의 발현량 등 미토콘드리아 기능 조절과 관련한 여러 실험을 함께 수행하지 못했다. 본 연구는 황기의 항비만 및 인슐린 저항성 개선과 관련한 미토콘드리아 기능 조절 효과를 탐색하기 위한 기초 연구로서의 의미를 가지며 상기의 실험 내용을 보강한 후속 연구를 통해 황기의 효능을 보다 명확하게 밝혀내고자 한다.
- 그러나 골격근에서 미토콘드리아 조절과 관련한 황기의 작용에 대해서는 관련 연구를 찾을 수가 없었다. 이에 본 연구에서는 C2C12 골격근세포를 이용한 세포 배양모델에서 황기의 미토콘드리아 조절 효과를 연구하고자 하였다. 이를 위해 미토콘드리아 생합성 관련 전사인자 및 에너지 대사와 미토콘드리아 생합성을 활성화시키는 AMPK의 활성도를 실험하였으며, 또한 미토콘드리아가 근육 분화를 조절함에 착안하여 근육 분화도를 동시에 측정하였다.
제안 방법
- 그 후 horse serum 2%로 근육세포의 분화를 유도하였다. 24시간마다 배지를 교환하면서 6일간 분화시킨 후, 약물을 처리하였다.
- C2C12 근육세포 분화과정 중, 시료에 의한 세포의 손상 정도를 관찰하였다. 마우스 유래 C2C12 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC) (CRL-1772; Manassas, VA, USA)으로부터 분양 받아 사용하였다.
- C2C12 세포를 실험 전날 1×106 cells/ml 농도로 96-well plate에 seeding하고, 황기 추출물을 0.2, 0.5 및 1.0 mg/ml를 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 1% Triton X-100), 250 μM dNTP, 1U Tag polymerase 등을 혼합한 후 denaturation을 위해 94℃에서 30초, annealing을 위해 55∼60℃에서 30초 및 extension을 위해 70℃에서 60초 조건에서 30 cycles을 수행하였다. PCR 반응물은 EtBr이 포함된 1% agarose gel을 이용하여 전기 영동한 후 UV lamp를 이용하여 확인하였으며, 이미지(Image-J) 프로그램을 이용하여 도표화하였다. PCR 반응물은 이미지(Image-J) 프로그램을 이용하여 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase에 대한 발현 비율(ratio)로 표시하였다.
- PCR 반응물은 EtBr이 포함된 1% agarose gel을 이용하여 전기 영동한 후 UV lamp를 이용하여 확인하였으며, 이미지(Image-J) 프로그램을 이용하여 도표화하였다. PCR 반응물은 이미지(Image-J) 프로그램을 이용하여 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase에 대한 발현 비율(ratio)로 표시하였다.
- PCR을 수행하기 위해서 mRNA로부터 합성된 cDNA 1μg에 mouse PGC1α pimers [sense; 5'-CAC CAA ACC CAC AGA AAA CAG-3’, antisense; 5’-GGG TCA GAG GAA GAG ATA AAG TTG], mouse NRF1 primers [sense; 5’-AAT GTC CGC AGT GAT GTC C-3’, antisense; 5’-GCC TGA GTT TGT GTT TGC TG-3’], mouse Tfam primers [sense; 5’-CAC CCA GAT GCA AAA CTT TCA G-3’, antisense; 5’-CTG CTC TTT ATA CTT GCT CAC AG-3’], mouse MHC primers [sense; 5’-TGA ACT GGA GGG TGA GGT AG-3’, antisense; 5’-TTC GGT CTT CTT CTG TCT GG-3’], 표준 대조구인 mouse GDPAH pimers [sense; 5'-ATT CAA CGG CAC ACT CAA GG-3’, antisense; 5’-CAG TGT AGC CCA AGA TGC CCT-3’] 및 10×PCR buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250 μM dNTP, 1U Tag polymerase 등을 혼합한 후 denaturation을 위해 94℃에서 30초, annealing을 위해 55∼60℃에서 30초 및 extension을 위해 70℃에서 60초 조건에서 30 cycles을 수행하였다.
- 이를 Tris-buffered Saline and Tween 20 (TBS-T)로 3회 세척한 후 anti-pAMPK, AMPK (cell signaling)로 각각 처치한 후, 상온에서 1시간 반응시키고 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액으로 기질반응시켜 x-ray film에 감광하였다. X-ray film상의 밴드는 이미지(Image-J; National Institutes of Health, public domain) 프로그램을 이용하여 AMPK에 대한 pAMPK의 발현 비율로 표시하였다.
- 골격근 세포에서 peroxisome proliferators-activated receptror γ coactivator 1α (PGC1α), nuclear respiratory factors 1 (NRF1)과 mitochondrial transcription factor (Tfam) 및 myosin heavy chain (MHC)의 mRNA 발현량을 측정하기 위해 reverse transcriptase-polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다. 골격근 세포를 6일간 분화시킨 후, 각 농도별 ARE 및 metformin을 24시간 동안 처리하였다. 각 세포를 수거하여 5,000 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 TRIzol 시약을 이용하여 total RNA를 분리하였다.
- AMPK, pAMPK의 단백질 발현량을 Western blot을 수행하여 측정하였다. 골격근 세포를 6일간 분화시킨 후, 여러 농도의 황기 물 추출물(0.2, 0.5, 1.0 mg/ml)을 처리하여 45분간 배양하였다. 세포를 수거하여 5,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 phosphate buffer saline 용액으로 2회 세척하고 lysis 용액(50 mM HEPES, pH 7.
- C2C12 근육세포는 60 mm petridish에 각각 1×106의 seeding한 후, fetal bovine serum (10%) 및 penicillin-streptomycin (1%)을 함유한 고농도 포도당 Dulbeco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (89%)에서 100% confluence될 때까지 배양하였다. 그 후 horse serum 2%로 근육세포의 분화를 유도하였다. 24시간마다 배지를 교환하면서 6일간 분화시킨 후, 약물을 처리하였다.
- 본 연구에서는 대표적인 AMPK activator로 골격근 조직에서 PGC1α 증가 효과가 밝혀진 metformin6)을 양성 대조군으로 설정하고 골격근 세포에서의 황기 물 추출물의 효과를 비교하였다.
- . 본 연구에서는 황기가 골격근 분화도에 영향을 미치는지를 조사하기 위하여 6일간 분화 뒤 24시간 약물을 처리한 후, 분화 후기 상태에서 군별 분화도의 차이를 고배율 현미경을 통해 형태적인 차이를 관찰하였으며, 분화 후기 myotube 상태에서 활성이 나타나는 MHC18)의 mRNA 발현량을 평가하였다. 실험 결과, myotube의 형성 및 MHC의 mRNA 발현량 모두 황기군에서 농도가 높아짐에 따라 증가하는 양상이 보였고, 대조군과의 비교 시에도 약간의 차이가 있었다.
- 이에 본 연구에서는 C2C12 골격근세포를 이용한 세포 배양모델에서 황기의 미토콘드리아 조절 효과를 연구하고자 하였다. 이를 위해 미토콘드리아 생합성 관련 전사인자 및 에너지 대사와 미토콘드리아 생합성을 활성화시키는 AMPK의 활성도를 실험하였으며, 또한 미토콘드리아가 근육 분화를 조절함에 착안하여 근육 분화도를 동시에 측정하였다.
- . 이에 본 연구에서는 대표적인 AMPK activator로서 미토콘드리아 생합성 작용이 알려진 metformin5)을 양성 대조군으로 설정하여 AMPK, pAMPK의 단백질 발현량을 측정하여 실험하였다. 그 결과 농도 의존적으로 pAMPK가 증가하는 것으로 나타났으며, 1.
- 황기는 (주)광명당제약(Kwangmyungdang Medicinal Herb, Ulsan, Korea)으로부터 표준약재를 구입하여 동국대학교 한의과대학 본초학교실에서 감별한 후 정선하여 시료로 사용하였다. 황기 200 g 정제수 2 L를 가하여 열탕추출기에서 3시간씩 2회 가열하여 얻은 추출물을 여과지(Whatman NO. 1)로 여과한 후 회전식 감압농축기로 감압농축하고 동결 건조하여 황기 물 추출물(Astragali Radix extract)을 제조하였다.
- 황기 물추출물이 C2C12의 골격근 세포의 생존율에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간 동안 처리한 결과 모든 농도에서 유의한 변화는 나타나지 않았다(Fig.
대상 데이터
- C2C12 근육세포 분화과정 중, 시료에 의한 세포의 손상 정도를 관찰하였다. 마우스 유래 C2C12 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC) (CRL-1772; Manassas, VA, USA)으로부터 분양 받아 사용하였다. C2C12 근육세포는 60 mm petridish에 각각 1×106의 seeding한 후, fetal bovine serum (10%) 및 penicillin-streptomycin (1%)을 함유한 고농도 포도당 Dulbeco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (89%)에서 100% confluence될 때까지 배양하였다.
- 황기는 (주)광명당제약(Kwangmyungdang Medicinal Herb, Ulsan, Korea)으로부터 표준약재를 구입하여 동국대학교 한의과대학 본초학교실에서 감별한 후 정선하여 시료로 사용하였다. 황기 200 g 정제수 2 L를 가하여 열탕추출기에서 3시간씩 2회 가열하여 얻은 추출물을 여과지(Whatman NO.
이론/모형
- AMPK, pAMPK의 단백질 발현량을 Western blot을 수행하여 측정하였다. 골격근 세포를 6일간 분화시킨 후, 여러 농도의 황기 물 추출물(0.
- C2C12에 대한 시료의 세포 생존능 평가는 thiazoly blue tetrazolium bromid (MTT)를 이용하여 측정하였다. C2C12 세포를 실험 전날 1×106 cells/ml 농도로 96-well plate에 seeding하고, 황기 추출물을 0.
- 골격근 세포에서 peroxisome proliferators-activated receptror γ coactivator 1α (PGC1α), nuclear respiratory factors 1 (NRF1)과 mitochondrial transcription factor (Tfam) 및 myosin heavy chain (MHC)의 mRNA 발현량을 측정하기 위해 reverse transcriptase-polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다.
성능/효과
- PGC1α, NRF1의 mRNA 발현량은 1.0 mg/ml의 농도에서 양성 대조군인 metformin과 유사한 수준으로 증가했으며, Tfam의 경우 1.0 mg/ml의 농도에서 양성 대조군보다 발현량이 더욱 증가한 것으로 나타났다(Fig. 3).
- 이에 본 연구에서는 대표적인 AMPK activator로서 미토콘드리아 생합성 작용이 알려진 metformin5)을 양성 대조군으로 설정하여 AMPK, pAMPK의 단백질 발현량을 측정하여 실험하였다. 그 결과 농도 의존적으로 pAMPK가 증가하는 것으로 나타났으며, 1.0 mg/ml의 농도에서는 양성 대조군인 metformin에 비해서도 더욱 증가한 것으로 나타났다(Fig. 2).
- 미토콘드리아 생합성 관련 전사인자인 PGC1α, NRF1, Tfam의 mRNA 발현량을 측정하였을 때, PGC1α, NRF1 및 Tfam은 대조군에 비해서 농도 의존적으로 발현량이 증가하였다.
- 4). 분화 시작 6일 뒤, 즉 분화 후기에 약물을 24시간 처치하고 군별로 세포의 형태 차이를 살펴본 결과, 황기군에서는 농도가 증가할수록 myoblast가 보다 치밀하게 형성된 것을 관찰할 수 있었고, 황기 1.0 mg/ml 농도의 경우 대조군에 비해서도 myoblast의 형성이 보다 밀도 있게 이뤄진 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5A). 한편, 근육 세포 분화의 후기 단계에서 관련된 전사인자인 MHC의 mRNA 발현량을 측정했을 때 대조군에 비해서 황기 처치 시 증가하는 양상이 보였지만, 발현량의 차이가 뚜렷하지는 않았다(Fig.
- 분화배지로 C2C12세포를 6일간 배양했을 때, 개별적으로 존재하던 myoblaste들이 시일이 경과함에 따라 세포들이 서로 융합되고 크기가 크고 길어지면서 점차 myotube의 형태를 형성함을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 분화 시작 6일 뒤, 즉 분화 후기에 약물을 24시간 처치하고 군별로 세포의 형태 차이를 살펴본 결과, 황기군에서는 농도가 증가할수록 myoblast가 보다 치밀하게 형성된 것을 관찰할 수 있었고, 황기 1.
- 본 연구에서는 황기가 골격근 분화도에 영향을 미치는지를 조사하기 위하여 6일간 분화 뒤 24시간 약물을 처리한 후, 분화 후기 상태에서 군별 분화도의 차이를 고배율 현미경을 통해 형태적인 차이를 관찰하였으며, 분화 후기 myotube 상태에서 활성이 나타나는 MHC18)의 mRNA 발현량을 평가하였다. 실험 결과, myotube의 형성 및 MHC의 mRNA 발현량 모두 황기군에서 농도가 높아짐에 따라 증가하는 양상이 보였고, 대조군과의 비교 시에도 약간의 차이가 있었다. 그러나 근육 분화 및 근육 비대에 대한 약물의 효과를 명확하게 연구하기 위해서는 증식기, 분화기 및 분화 종료기로 나누어서 각 단계별로 약물을 처리하여 분화의 전 과정에서 약물의 효과를 확인하는 것이 필요한데 본 연구에서는 분화 종료기에만 약물의 처리하여 분화 전 과정에 걸친 약물의 분화 촉진 효과를 확인하지 못한 한계가 있다.
- 황기 물 추출물은 농도가 증가할수록 AMPK의 인산화를 증가시켜 AMPK를 활성화시켰으며, 미토콘드리아 생합성 조절인자인 PGC1α, NRF 및 Tfam의 mRNA의 발현량이 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 실험 결과, myotube의 형성 및 MHC의 mRNA 발현량 모두 황기군에서 농도가 높아짐에 따라 증가하는 양상이 보였고, 대조군과의 비교 시에도 약간의 차이가 있었다. 그러나 근육 분화 및 근육 비대에 대한 약물의 효과를 명확하게 연구하기 위해서는 증식기, 분화기 및 분화 종료기로 나누어서 각 단계별로 약물을 처리하여 분화의 전 과정에서 약물의 효과를 확인하는 것이 필요한데 본 연구에서는 분화 종료기에만 약물의 처리하여 분화 전 과정에 걸친 약물의 분화 촉진 효과를 확인하지 못한 한계가 있다. 미토콘드리아 근육 분화의 조절 작용을 하는 것으로 알려져 있기 때문에, 후속 연구를 통해 미토콘드리아 조절 작용을 통한 황기의 근육 세포 분화 촉진 효과를 보다 명확하게 규명할 필요가 있다.
- 단회 실험만의 결과로서 반복 실험을 통해 재현성을 확보하지 못했으며, 또한 지방산 산화도, ATP 생산량, 미토콘드리아의 양 및 AMPK와 PGC1α와 연관된 효소인 SIRT1, ACC의 발현량 등 미토콘드리아 기능 조절과 관련한 여러 실험을 함께 수행하지 못했다.
- 그러나 근육 분화 및 근육 비대에 대한 약물의 효과를 명확하게 연구하기 위해서는 증식기, 분화기 및 분화 종료기로 나누어서 각 단계별로 약물을 처리하여 분화의 전 과정에서 약물의 효과를 확인하는 것이 필요한데 본 연구에서는 분화 종료기에만 약물의 처리하여 분화 전 과정에 걸친 약물의 분화 촉진 효과를 확인하지 못한 한계가 있다. 미토콘드리아 근육 분화의 조절 작용을 하는 것으로 알려져 있기 때문에, 후속 연구를 통해 미토콘드리아 조절 작용을 통한 황기의 근육 세포 분화 촉진 효과를 보다 명확하게 규명할 필요가 있다.
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