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문제 정의
- 반응산물의 염기서열, 크기 및 GC비율에 따라 특징적인 melting curve을 보여 전기영동 하지 않고 반응산물을 확인할 수 있다(Tripathi 등, 2013). 본 연구에서는 대학병원으로부터 VRE균주를 분리하여 항생제감수성 검사를 실시하고 일반PCR 및 real-time PCR 방법을 실시하여 신속검출의 유용성을 평가 하였다.
제안 방법
- 10 μL의 iQ SYBR Green Supermix, 2 μL의 primer혼합액, 1 μL의 DNA, 7 μL의 멸균증류수 넣어 반응액 20 μL를 제조하여 real-time PCR을 실시하였다.
- 23개의 VRE 균주를 가온법을 이용하여 DNA를 추출하였다. 순수 분리된 23개 균주를 90℃에서 10분방치 후 진탕 하였다.
- 5 mM), 10× PCR buffer 2 μL, primer 10 pmol 각각 1 μL씩 넣었고, genomic DNA (25 μg) 1 μL, Taq DNA polymerase (2 unit) 1 μL, 최종 반응액은 증류수로 20 μL 되게끔 실시하였다. DNA thermal cycler (Perkin Elmer, Inc. Wellesley, MA, USA)에서 Van 유전자 검출은 95℃에서 1분간 변성, 64℃에서 2분간 접합, 72℃에서 1분 30초간 확장의 순서로 35회를 시행하고 72℃에서 7분간 최종확장 하였다. PCR 증폭산물을 1.
- PCR 증폭산물을 1.5% agarose gel에 midori green (2 μL)을 넣어 1 × TAE buffer에서 70 volt, 100 mA로 45분 동안 전기영동을 실시한 다음, agarose gel을 UV transilluminator로 관찰하고, Gel Doc (Bio-Red, Inc. Hercules, CA, USA)이미지 분석장치로 사진 촬영 하였다.
- PCR을 위한 PCR 혼합액 dNTP (2.5 mM), 10× PCR buffer 2 μL, primer 10 pmol 각각 1 μL씩 넣었고, genomic DNA (25 μg) 1 μL, Taq DNA polymerase (2 unit) 1 μL, 최종 반응액은 증류수로 20 μL 되게끔 실시하였다.
- iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)을 사용하여 real-time PCR을 실시하였다. 10 μL의 iQ SYBR Green Supermix, 2 μL의 primer혼합액, 1 μL의 DNA, 7 μL의 멸균증류수 넣어 반응액 20 μL를 제조하여 real-time PCR을 실시하였다.
- 95℃에서 3분 반응 후 95℃에서 10초, 60℃에서 10초, 72℃에서 20초에서 반응을 40회 반복하였다. 마지막에서 PCR반응이 끝난 후 65℃에서 95℃까지 초당 0.5의 속도로 온도를 증가시키면서 융해곡선을 분석하였다.
- 세균 부유액을 혈액한천배지에 접종한 후 30℃배양기에서 18∼24시간 배양 후 집락 및 용혈유무를 관찰하였다, 순수분리집락을 도말하여 그람염색을 실시하였다. 생화학적 시험으로 catalase test, bile esculin test, arabinose분해, 6.5% NaCl배지에서 성장유무를 관찰하였다.
- 세균 부유액을 Mueller-Hinton Agar (MHA)에 고르게 접종한 후, 배지의 중앙에는 vancomycin (30 μg) 디스크와 teicoplanin (30 μg) 있는 디스크를 20 mm 간격으로 놓았다.
- 세균 부유액을 혈액한천배지에 접종한 후 30℃배양기에서 18∼24시간 배양 후 집락 및 용혈유무를 관찰하였다, 순수분리집락을 도말하여 그람염색을 실시하였다.
- 23개의 VRE 균주를 가온법을 이용하여 DNA를 추출하였다. 순수 분리된 23개 균주를 90℃에서 10분방치 후 진탕 하였다. 그리고 13,000 rpm서 5분간 원심 후 상층액을 얻었다.
대상 데이터
- 대학병원에서 VITEK II (bioMerieux, Inc. Haxelwood, MO, USA)기기로 vancomycin-resistance enterococci 세균으로 동정된 23균주를 대상으로 하였다.
- 분리균주 동정 및 항생제 감수성 검사 정도관리 균주로 Enterococcus faecium ATCC 19434 균주를 사용하였다.
이론/모형
- 10 μL의 iQ SYBR Green Supermix, 2 μL의 primer혼합액, 1 μL의 DNA, 7 μL의 멸균증류수 넣어 반응액 20 μL를 제조하여 real-time PCR을 실시하였다. Real-time PCR은 CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하였다. 95℃에서 3분 반응 후 95℃에서 10초, 60℃에서 10초, 72℃에서 20초에서 반응을 40회 반복하였다.
성능/효과
- 본 실험에서 표현형적 방법으로 분리된 VRE 23균주를 디스크감수성 시험 결과 모든 균주가 내성으로 나타났다. PCR방법에서 vanA 생성 Enterococcus균주는 23균주(100%)가 양성으로 나타났으며, vanB 생성 Enterococcus균주는 검출되지 않았다. vanA 생성 E.
- 일반 PCR에서 vanA 생성 Enterococcus균주는 23균주(100%)가 양성으로 나타났으며, vanB생성 Enterococcus균주는 검출되지 않았다. Real-Time PCR 분석 결과 23균주가 양성(melt peak 80.50℃)으로 나타나 일반 PCR결과와 일치하였다(Table 2, Fig. 1).
- 본연구에 사용한 Enterococcus spp. 균주에서는 VanA 유전자를 포함하고 있는 것으로 나타났으며 PCR 방법은 vanA, vanB 유전자의 검출과 이 유전자의 monitoring에 중요한 역할을 할 것이다. 따라서 real-time PCR방법은 VRE균주를 정확하고 신속하게 검출할 수 있어 원내감염의 감시배양에 유용한 방법이라 사료된다.
- 디스크감수성 시험에서는 vancomycin 디스크에서는 1∼23균주(100%)가 내성으로 나타났으며, 또한 teicoplanin 디스크에 모든 균주가 내성으로 나타났다(Table 2).
- 본 실험에서 표현형적 방법으로 분리된 VRE 23균주를 디스크감수성 시험 결과 모든 균주가 내성으로 나타났다. PCR방법에서 vanA 생성 Enterococcus균주는 23균주(100%)가 양성으로 나타났으며, vanB 생성 Enterococcus균주는 검출되지 않았다.
- 혈액한천배지에서 다양한 용혈양상을 보이고, 그람염색결과 그람양성 쌍알균, 사슬알균형태로 나타났다. 생화학적 시험결과 catalase음성, bile esculin양성, 6.5% NaCl에서 성장하였고 arabinose을 분해하여 E. faecium으로 동정하였다.
- 일반 PCR에서 vanA 생성 Enterococcus균주는 23균주(100%)가 양성으로 나타났으며, vanB생성 Enterococcus균주는 검출되지 않았다. Real-Time PCR 분석 결과 23균주가 양성(melt peak 80.
- 혈액한천배지에서 다양한 용혈양상을 보이고, 그람염색결과 그람양성 쌍알균, 사슬알균형태로 나타났다. 생화학적 시험결과 catalase음성, bile esculin양성, 6.
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