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문제 정의
- 후)세균수의">세균 수의 측정에 있어서, PMA 처리와 real-time qPCR 방법의 적용 가능성을 기존의 plate counting 방법과 비교하여 알아보는 것이다. 또한 열처리한 Cronobacter spp.
- 를 PMA 처리 후 real-time qPCR 방법을 사용하여 알아보는 것이다. 향후 Cronobacter와 관련된 영영ㆍ유아식품안전관리 연구방향을 제시하고자 한다.
제안 방법
- 그리고 eppendorf tube를 은박지에 싼 후 5분 동안 흔들어주면서 배양하였다. 650W halogen light (General Electric Co., USA)를 이용하여 표본에 2분 동안 빛을 노출시켰으며, 표본의 과도한 열을 피하기 위하여 얼음 위에 수평으로 눕히고, halogen 빛으로부터 20 cm의 거리를 유지하게 하였다. 빛에 의한 crosslinking이 일어난 후에, 표본은 14,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상부의 액을 제거한 후 PBS로 처리하였다.
- 5 μL, 샘플 DNA 5 μL로 총량을 25 μL로 하였다. ABI PRISM 7500HT sequence detection system(Applied Biosystems)을 사용하여 50℃에서 2분, 95℃에서 10분간 반응시킨 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분을 1회로 반응조건을 맞추어 40 cycles를 반응시켰다. Real-time PCR의 판정은 Seo 등(2005)의 연구를 참조하여, Ct 값이 38 이하인 경우이면서, 곡선이 S자형(sigmoid)의 Cronobacter sakazakii를 37℃에서 3시간 동안 배양하여 PMA 처리한 후 단계적으로 10배의 연속희석을 시행하여 각 표본을 DNA extraction 시행한 후에 real-time qPCR을 시행하였다. Cronobacter sakazakii의 양이 단계적으로 증가할수록 Ct value는 단계적으로 감소하였다.
- Cronobacter sakazakii를 37℃에서 3시간 동안 배양하여 단계적으로 10배의 연속희석을 시행하여 각 표본을 DNA extraction 시행한 후에 real-time qPCR을 시행하였다. Cronobacter sakazakii의 양이 단계적으로 증가할수록 Ct value는 단계적으로 세균의 대조군과 처리군들은 아래와 같은 방법으로 하였다. Nutrient agar plate에서 one colony를 선별하여 10 mL Nutrient broth에 접종한 후 37℃에서 3시간 동안 배양한 것을 대조군으로 하였으며, 첫 번째 처리군은 동일한 방법으로 한 후 75℃에서 15분간 불활성화 것이며, 그리고 두 번째 처리군은 대조군과 첫 번째 처리군을 1:1로 혼합한 것이다. 준비된 대조군과 처리군 샘플에서 500 μL에 1.
- 후)반응 조건을">반응조건을 맞추어 40 cycles를 반응시켰다. Real-time PCR의 판정은 Seo 등(2005)의 연구를 참조하여, Ct 값이 38 이하인 경우이면서, 곡선이 S자형(sigmoid)의 증폭양상을 보이는 경우에 양성으로 판정하였다.
- 각 반응액의 조성은 TaqMan® universal PCR master mix(Applied Biosystems) 12.5 μL, forward and reverse primer(900 nM) 각각 2.5 μL, probe(250 nM) 2.5 μL, 샘플 DNA 5 μL로 총량을 25 μL로 하였다.
- 반면에 Cronobacter sakazakii 를 37℃에서 3시간 동안 배양한 후, 즉시 75℃에서 15분간 불활성화시킨 후 PMA 처리하였다. 그 후 단계적으로 10배의 연속희석을 시행하여 각 표본을 DNA extraction 시행한 후에 real-time PCR을 시행하였다. 여기에서는 Cronobacter sakazakii의 Ct 값이 35를 넘어서 40에 가까운 값을 다음으로">2). 다음으로 Cronobacter sakazakii를 37℃에서 3시간 동안 배양한 후 즉시 75℃에서 15분간 불활성화시킨 후 단계적으로 10배의 연속희석을 시행하여 각 표본을 DNA extraction 시행한 후에 real-time PCR을 시행하였다. Cronobacter sakazakii의 양이 단계적으로 증가할수록 Ct value는 단계적으로 2). 또한 살아있는 Cronobacter sakazakii 세균과 75℃에서 15분간 불활성화시킨 Cronobacter sakazakii 세균을 1:1로 희석하여 단계적으로 10배의 연속희석을 시행하여 각 표본을 DNA extraction 시행한 후에 real-time PCR을 시행하였다. 여기에서도 동일하게 Cronobacter sakazakii의 양이 단계적으로 증가할수록 Ct 값은 단계적으로 감소를 이것은 PMA 처리에 의해서 살아있는 적은 세균만이 증폭하여 높은 Ct 값을 보인 것으로 사료된다. 또한 살아있는 Cronobacter sakazakii 세균과 75℃에서 15분간 불활성화시킨 후 Cronobacter sakazakii 세균을 1:1로 희석하여 PMA 처리한 후 단계적으로 10배의 연속희석을 시행하여 각 표본을 DNA extraction 시행한 후에 real-time PCR을 시행하였다. 여기에서는 Cronobacter sakazakii의 양이 단계적으로 증가할수록 Ct value는 단계적으로 감소를 보였지만, Cronobacter sakazakii를 37℃에서 3시간 동안 배양하여 PMA 처리한 것보다는 전반적으로 Ct 값이 높게 나타났다(Fig.
- 반면에">3). 반면에 Cronobacter sakazakii 를 37℃에서 3시간 동안 배양한 후, 즉시 75℃에서 15분간 불활성화시킨 후 PMA 처리하였다. 그 후 단계적으로 10배의 준비된 대조군과 처리군 샘플에서 500 μL에 1.25 μL의 PMA를 처리한 후, PMA 처리와 DNA extraction을 한 후에 real-time PCR로 분석하였다.
대상 데이터
-
Cronobacter sakazakii는 미국 FDA(Food and Drug Administration, Washington DC, USA)부터 분양 받아 실험실에서 보유하고 있던 식품분리균주를 사용하였으며, －70℃에 보관하여 필요할 때마다 균주를 해동하여 사용하였다. Nutrient agar(NA; Difco, USA)에
데이터처리
- 배지배양법과 real-time PCR과의 검출율 차이분석은 통계프로그램인 GraphPad Instat(GraphPad Software, Inc., USA)을 사용하였으며, Fisher’s exact test로 양성검출율의 통계학적인 유의차(p<0.05)를 분석하였다.
이론/모형
- Real-time qPCR 수행을 위한 primers/probe의 서열은 macro-molecular synthesis(MMS) operon gene를 타겟으로 개발된 시퀀스를 사용하였다. 해당 유전자 서열은 이전 연구에서 개발되어(Seo and Brackett, 2005) 다양한 균주에서 그 민감도와 특이도가 검증되었으며, Table 1에 제시되어 있다.
성능/효과
- 그리고 표준평판법에 의한 실험에서는 Cronobacter sakazakii 를 37℃에서 3시간 동안 배양한 후 PMA 처리한 표본에서는 2.0×108CFU/mL를 보였으며, Cronobacter sakazakii를 37℃에서 3시간 동안 배양한 후 즉시 75℃에서 15분간 불활성화시킨 후 PMA 처리한 표본에서는 0 CFU/mL를 보였으며, 살아 있는 Cronobacter sakazakii 세균과 75℃에서 15분간 불활성화시킨 Cronobacter sakazakii 세균을 1:1로 희석한 후 PMA 처리한 표본에서는 7.2×108CFU/mL를 보였다.
- 또한 PMA 처리와 real-time qPCR 방법으로 Cronobacter sakazakii를 표본으로 사용하여 성공적으로 적용됨을 본 실험을 통해서 확인할 수 있었다. 더 나아가서 다양한 환경 중에서 75℃에서 15분간 노출된 후 Cronobacter sakazakii 세포막의 온전함을 평가하는 데에 있어서도 PMA 처리방법이 빠르고 재현 가능한 방법임을 본 실험에서 보여주었다. 따라서 향후 PMA 처리와 real-time qPCR 방법으로 다양한 식품에서 Cronobacter sakazakii를 검출하는 방법으로 확립되기 위해서는 validation 연구가 진행되어야 할 것이다.
- 따라서 본 실험의 결과에서 Cronobacter sakazakii가 살아있는 경우와 죽은 경우에도 모두 real-time qPCR을 시행한 후 분석결과, Ct 값과 희석배수와는 반비례의 관계를 보였다. 즉, Cronobacter sakazakii 세균의 검출은 기존의 후)노출하에서">노출 하에서 죽은 세균의 DNA와 crosslinking을 하며(Liu and Mustapha, 2014), real-time qPCR을 시행하였을 때에는 살아있는 Cronobacter sakazakii 세균만 선택적으로 검출되었기 때문이다. 따라서 살아있는 Cronobacter sakazakii 세균의 검출이 요구될 때에는 PMA 처리와 real-time qPCR 방법 그리고 표준평판법을 동시에 이용하는 것이 가장 바람직한 것으로 사료된다.
- 후)더욱 더">더욱더 큰 의미가 있다고 사료된다. 또한 PMA 처리와 real-time qPCR 방법으로 Cronobacter sakazakii를 표본으로 사용하여 성공적으로 적용됨을 본 실험을 통해서 확인할 수 있었다. 더 나아가서 다양한 환경 중에서 75℃에서 15분간 노출된 후 Cronobacter sakazakii 세포막의 온전함을 평가하는 데에 있어서도 PMA 본 실험의 결과에서 Cronobacter sakazakii가 살아 있는 경우와 죽은 경우에도 PMA 처리한 후 real-time PCR을 시행한 후 결과, 살아있는 Cronobacter sakazakii 세균과 죽은 Cronobacter sakazakii 세균과의 구별이 가능함을 보였다.
- 본">2008). 본 실험의 결과에서 살아있는 세균의 양이 증가할수록 Ct 값이 감소하는 것이 관찰되었다. PMA 처리 여부에 따라서 Ct 값의 차이가 나타나는 것은 다음과 같은 이유인데, 즉 PMA가 빛 후)연속 희석을">연속희석을 시행하여 각 표본을 DNA extraction 시행한 후에 real-time PCR을 시행하였다. 여기에서는 Cronobacter sakazakii의 양이 단계적으로 증가할수록 Ct value는 단계적으로 감소를 보였지만, Cronobacter sakazakii를 37℃에서 3시간 동안 배양하여 PMA 처리한 것보다는 전반적으로 Ct 값이 높게 나타났다(Fig. 3).
- 후)연속 희석을">연속희석을 시행하여 각 표본을 DNA extraction 시행한 후에 real-time PCR을 시행하였다. 여기에서도 동일하게 Cronobacter sakazakii의 양이 단계적으로 증가할수록 Ct 값은 단계적으로 감소를 보였다(Fig. 2).
-
후)분석 결과,">분석결과, Ct 값과 희석배수와는 반비례의 관계를 보였다. 즉, Cronobacter sakazakii 세균의 검출은 기존의 표준평판법의 대체 방법으로써 real-time qPCR 방법을 이용하는 것이 가능하며, 본 실험의 결과에서도 Cronobacter sakazakii 세균에 대한 real-time qPCR 조건은 매우 적합한 것으로 나타났다. 하지만, real-time qPCR 방법만으로는 죽은 세균까지 모두 검출이 되는 한계를 가지고 있는데, 본 실험의 결과에서도
후속연구
- 결론적으로 PMA 처리와 real-time qPCR 방법은 빠르고 간단한 방법이며, 앞으로 DNA-based assay를 기반으로 하여 더욱더 활발하게 사용될 것으로 사료된다. 특히 기존의 PCR 방법이 살아있는 세균과 죽은 세균을 구분하지 못하고 함께 증폭시키는 단점이 있는 반면에, PMA를 이용한 그리고 PMA 처리 시에는 죽은 세균으로 판단되었던 것이 실제 배양을 해보면 배양이 될 수도 있다는 가능성도 존재할 수가 있을 것이다. 왜냐하면 이것은 후)처리 방법이">처리방법이 빠르고 재현 가능한 방법임을 본 실험에서 보여주었다. 따라서 향후 PMA 처리와 real-time qPCR 방법으로 다양한 식품에서 Cronobacter sakazakii를 검출하는 방법으로 확립되기 위해서는 validation 연구가 진행되어야 할 것이다. 또한 극한 조건에서 생존한 Cronobacter sakazakii의 검출에 PMA 처리와 real-time qPCR 방법의 따라서 향후 PMA 처리와 real-time qPCR 방법으로 다양한 식품에서 Cronobacter sakazakii를 검출하는 방법으로 확립되기 위해서는 validation 연구가 진행되어야 할 것이다. 또한 극한 조건에서 생존한 Cronobacter sakazakii의 검출에 PMA 처리와 real-time qPCR 방법의 이용가능성도 고려되어야 할 것이다.
- 후)표준 배양법에서는">표준배양법에서는
- 후)대체방법으로써">대체 방법으로써 real-time qPCR 방법을 이용하는 것이 가능하며, 본 실험의 결과에서도 Cronobacter sakazakii 세균에 대한 real-time qPCR 조건은 매우 적합한 것으로 나타났다. 하지만, real-time qPCR 방법만으로는 죽은 세균까지 모두 검출이 되는 한계를 가지고 있는데, 본 실험의 결과에서도 살아 있는 세균과 죽은 세균의 구분이 되지 않음을 보였다.
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