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문제 정의
- 1. Neighbor-joining phylogenetic tree for partial 18S rDNA sequence of arbuscular mycorrhizal fungal spores in this study. Numbers at nodes indicate bootstrap support (1,000 replicates).
가설 설정
- C. luteum의 포자벽들은 Melzer's reagent에 의한 염색 반응은 나타나지 않는다.
제안 방법
- 1차 PCR은 universal 프라이머인 NS1/NS4를 이용하였고 1차 PCR 반응물을 1/10으로 희석하여 2차 PCR의 주형으로 사용하였다. 2차 PCR은 수지상균근균 특이 프라이머인 AML1/AML2를 이용하였고 2차 PCR 반응물을 1.5% agarose gel상의 전기 영동(100V, 25분)을 이용하여 약 780 bp의 PCR 반응물을 확인한 후 염기서열 분석을 의뢰하였다(Solgent, Korea). 염기서열 정보는 NCBI(http://www.
- 물은 1일 1회 충분히 급수하였다. 3개월 후기주식물과 수수가 충분히 자란 후 급수를 중지하고 4주간 자연 건조하였으며 건조가 끝난 후 4o C의 저온실에 토양을 저장한 후 포자 추출에 이용하였다.
- trimurales, Rhizophagus irregularis. 각 종의 형태적 특징 및 계통관계를 제시하였다. 본 연구는 우리나라 수지상균근균의 다양성 연구에 유용할 것으로 판단된다.
- 대량배양에 성공한 종은 슬라이드 표본을 제작하여 각종의 형태적 특징을 관찰하였다. 슬라이드 글라스에 포자를 두 그룹으로 나누어 모아놓고 한쪽에는PVLG(polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol)를, 그리고 다른 쪽에는 PVLG 와 Melzer's reagent를 1:1로 섞은 고정액을 떨어뜨린 후 커버 글라스를 덮고 적당한 압력을 주어 포자를 깨뜨리고 슬라이드 표본을 제작하였다.
- 본 연구에서 4속 5종의 수지상균근균을 동정하였다: Acaulospora cavernata, Claroideoglomus luteum, Diversispora aurantium, D. trimurales, Rhizophagus irregularis 18S rDNA를 이용하여 계통분석을 수행하였으며(Fig. 1), 각 종의 포자의 형태적 특징은 아래와 같다.
- 그러나 생태계에서 수지상균근균의 역할과 생태적 중요성을 생각해 볼 때, 토양의 중요 미생물인 수지상균근균을 수집하고 배양하여 순수 균주를 확보하는 것은 수지상균근균의 생물적 특성을 파악할 뿐만 아니라 식물과 수지상균근균의 공생 관계를 이해하는데도 중요한 과제이다. 본 연구에서는 우리나라의 다양한 지역으로부터 식물근권에서 토양을 수집하여 식물과 함께 배양한 후, 5속 8종의 형태적 특징을 기재하고 분자생물학적 종 동정을 수행하였다.
- 슬라이드 글라스에 포자를 두 그룹으로 나누어 모아놓고 한쪽에는PVLG(polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol)를, 그리고 다른 쪽에는 PVLG 와 Melzer's reagent를 1:1로 섞은 고정액을 떨어뜨린 후 커버 글라스를 덮고 적당한 압력을 주어 포자를 깨뜨리고 슬라이드 표본을 제작하였다.
- 슬라이드 글라스에 포자를 두 그룹으로 나누어 모아놓고 한쪽에는PVLG(polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol)를, 그리고 다른 쪽에는 PVLG 와 Melzer's reagent를 1:1로 섞은 고정액을 떨어뜨린 후 커버 글라스를 덮고 적당한 압력을 주어 포자를 깨뜨리고 슬라이드 표본을 제작하였다. 슬라이드 표본은 광학현미경(AXIO Imager. A1, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하면서 포자벽의 수와 구조, 포자벽 표면 장식(ornament) 및 부착 균사의 유무와 특징을 관찰하여 기재하였다[5-8].
- 5% agarose gel상의 전기 영동(100V, 25분)을 이용하여 약 780 bp의 PCR 반응물을 확인한 후 염기서열 분석을 의뢰하였다(Solgent, Korea). 염기서열 정보는 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 일치도가 가장 높은 종을 확인하였다. 확인된 종들에 대한 염기서열을 NCBI로부터 내려 받아 MEGA 5를 이용하여 alignment한 후 유연관계 계통도를 작성하여 종을 동정하였다[10].
- 정확한 동정을 수행하기 위해 각 포자의 18S rDNA 염기서열을 분석하였다. 육안상 깨끗한 포자를 골라 0.2 mL의 PCR 튜브에 옮겨 담아 포자를 파쇄한 후 nested PCR을 수행하였다[9]. 1차 PCR은 universal 프라이머인 NS1/NS4를 이용하였고 1차 PCR 반응물을 1/10으로 희석하여 2차 PCR의 주형으로 사용하였다.
- 정확한 동정을 수행하기 위해 각 포자의 18S rDNA 염기서열을 분석하였다. 육안상 깨끗한 포자를 골라 0.
- gov)에서 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 일치도가 가장 높은 종을 확인하였다. 확인된 종들에 대한 염기서열을 NCBI로부터 내려 받아 MEGA 5를 이용하여 alignment한 후 유연관계 계통도를 작성하여 종을 동정하였다[10].
대상 데이터
- 3. Claroideoglomus luteum (CN14012). A, spore in PVLG; B, C, spore wall structure.
- 5. Diversispora trimurales (CN14129). A, B, spores in PVLG.
- 부착균사의 벽과 포자벽의 세 개의 벽은 서로 이어져 있다. 관찰균주는 CN14006이며, 충남 대천에 서식하는 쥐똥나무(Ligustrum obtusifo lium)의 근권에서 분리하였다.
- irregularis는 L3가 염색되기 때문에 서로 구분 가능하다. 관찰균주는 CN14040이며, 충남 삽시도에 서식하는 쥐똥나무(Ligustrum obtusifolium)의 근권에서 분리하였다.
- 부착균사의 벽은 기저부에서 포자의 3개의 벽과 이어져 있다. 관찰균주는 CN14129이며, 충남대난지도에 서식하는 초피나무(Zanthoxylum bungeanum)의 근권에서 분리하였다.
- claroideum 및 Rhizophagus clarus와 포자의 형태가 유사하나 포자벽의 비교를 통해 이들을 구분할 수 있다. 관찰표본은 CN14012이며, 충남 원산도에서 서식하는 광릉개밀(Agropyron yezoense) 근권에서 분리하였다.
- 2C). 관찰표본은 GB13123이며 경북 문수산의 팥 배나무(Sorbus alnifolia) 근권에서 분리하였다.
- 근권 토양의 수집은 경상북도과 충청남도 지역에서 수행하였다. 채집지역에서 다양한 기주식물과 기주식물의 근권 토양을 수집하였다.
- 본 연구에서는 우리나라 목본식물의 근권에서 수지상균근균을 분리하여 배양하였다. 형태 및 18S rDNA 염기서열분석을 통해 총 4개 속 5개 종의 수지상균근균을 동정하였으며 이들 균은 현재까지 국내미기록종이다; Acaulospora cavernata, Claroideoglomus luteum, Diversispora aurantium, D.
- 기주식물의 뿌리가 상하지 않도록 조심하여 채집한 후 근권 토양을 1 kg 정도 함께 채취하여 밀폐 가능한 비닐백에 함께 옮겨 담아 실험실로 옮겨왔다. 실험실로 가져온 야외 토양은 121o C에서 20분간 멸균한 모래와 1:1의 부피로 섞어 포트에 옮겨 담아 다양한 수지상균근균에 감염될 수 있는 식물로 알려진 수수(Sorghum bicolor) 종자를 파종한 후 약 3개월간 일정한 온도의 배양실에서 배양하였다. 물은 1일 1회 충분히 급수하였다.
- 근권 토양의 수집은 경상북도과 충청남도 지역에서 수행하였다. 채집지역에서 다양한 기주식물과 기주식물의 근권 토양을 수집하였다. 기주식물의 뿌리가 상하지 않도록 조심하여 채집한 후 근권 토양을 1 kg 정도 함께 채취하여 밀폐 가능한 비닐백에 함께 옮겨 담아 실험실로 옮겨왔다.
이론/모형
- 수지상균근균 포자의 추출은 wet sieving and sucrose density gradient centrifugation 방법[2]을 이용하였으며 추출한 포자 중 포자의 크기, 색깔, 표면의 특징이 동일한 포자를 모아 순수배양에 이용하였다. 멸균한 모래를 깨끗한 포트에 옮겨 담고 무균 발아한 수수의 어린 식물을 옮겨 심었다.
성능/효과
- 본 연구에서는 우리나라 목본식물의 근권에서 수지상균근균을 분리하여 배양하였다. 형태 및 18S rDNA 염기서열분석을 통해 총 4개 속 5개 종의 수지상균근균을 동정하였으며 이들 균은 현재까지 국내미기록종이다; Acaulospora cavernata, Claroideoglomus luteum, Diversispora aurantium, D. trimurales, Rhizophagus irregularis. 각 종의 형태적 특징 및 계통관계를 제시하였다.
후속연구
- 특히 야외 토양에서 수집한 포자는 대부분 포자의 외관이 손상되어 형태적 특징을 뚜렷하게 관찰하기 어려워 과거에 보고된 국내 수지상균근균에 관해서는 배양체를 통한 형태적, 분자생물학적 동정 결과가 보완되어야 할 것으로 보인다. 그러나 수지상균근균은 식물과의 공생 관계를 통해서만 생장이 가능하기 때문에 현재까지 이 균의 단독 배양이 불가능한 점도 수지상균근균의 연구의 제한점이다. 그러나 생태계에서 수지상균근균의 역할과 생태적 중요성을 생각해 볼 때, 토양의 중요 미생물인 수지상균근균을 수집하고 배양하여 순수 균주를 확보하는 것은 수지상균근균의 생물적 특성을 파악할 뿐만 아니라 식물과 수지상균근균의 공생 관계를 이해하는데도 중요한 과제이다.
- 각 종의 형태적 특징 및 계통관계를 제시하였다. 본 연구는 우리나라 수지상균근균의 다양성 연구에 유용할 것으로 판단된다.
- 수지상균근균의 형태적 동정에 이용할 수 있는 형질의 수가 많지 않고, 형질의 특징이 불분명하기 때문에 포자의 형태를 이용한 종 수준의 동정에는 많은 어려움이 있다. 특히 야외 토양에서 수집한 포자는 대부분 포자의 외관이 손상되어 형태적 특징을 뚜렷하게 관찰하기 어려워 과거에 보고된 국내 수지상균근균에 관해서는 배양체를 통한 형태적, 분자생물학적 동정 결과가 보완되어야 할 것으로 보인다. 그러나 수지상균근균은 식물과의 공생 관계를 통해서만 생장이 가능하기 때문에 현재까지 이 균의 단독 배양이 불가능한 점도 수지상균근균의 연구의 제한점이다.
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