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문제 정의
- 본 연구는 과채류의 저장·유통중 상품적 가치를 저하시키는 푸른곰팡이에 대한 정향추출물의 항진균력을 확인한 후 정향으로부터 항균활성성분을 분리하고 그 구조를 확인하였다.
- 본 연구는 과채류의 저장·유통중 상품적 가치를 저하시키는 푸른곰팡이에 대한 정향추출물의 항진균력을 확인한 후 정향으로부터 항균활성성분을 분리하고 그 구조를 확인하였다. 이를 통해 정향이 항진균제로의 이용가능성을 과학적으로 평가하고 향후 과채류의 친환경적인 저장병 방제기술 개발을 위한 기초 자료로 제시하고자 한다.
제안 방법
- EI-MS은 HewlettPackard 6890 GC을 사용하였고, Column은 HP5-MS(30m×250㎛×0.25㎛), column 온도는 100℃에서 2분간 유지시킨 후 10℃/min으로 승온하여 280℃, 10 min 조건으로 분석하였다.
- Ⅰ과 Fr. Ⅱ을 각각 농축 한 후 chloroform : methanol(1:1, v/v)을 용출 용매로 하여 Sephadex LH-20 column chromatography를 수행하였고 이를 TLC로 분석한 결과 3개의 분취시료를 얻었다(Fig. 1). Column chromatography용 silica gel은 Kieselgel 60(70~230 mesh, Merck, Germany)을 사용하였고, Sephadex LH-20(GE Healthcare, Sweden)을 사용하였다.
- 따라서 본 연구를 통해 정향 추출물의 항진균력을 확인하고 그 유효성분을 분리하고 구조를 확인함으로써 향후 정향의 항진균제로의 이용가능성을 과학적으로 분석·평가하였다.
-
4. 정향 추출물의 항진균성 성분 화학구조 동정
정향 추출물을 용매별로 계통 분획하여 분리한 hexane 분획으로부터 silica gel column chromatography와 TLC monitoring하여 항진균성이 가장 우수한 black oil의 항진균성 물질을 얻었고 이들 화합물 JH-1, JH-2-1 및 JH-2-2라 명명하고 이들 화합물에 대한 화학구조를 규명하기 위해 CDCl3에 녹여 1H NMR, 13CNMR, 1H-1H COSY 등의 1차원 및 2차원 NMR spectrum을 측정하여 해석하였다
. JH-1화합물을 1H NMR spectrum을 측정한 결과, 6. - 정향을 건조시켜 분쇄한 후 50% ethanol로 추출한 것을 10%의 농도로 희석하여 20~50㎕까지 10㎕간격으로 첨가하여 부패 미생물의 농도별 생육저해 효과를 paper disc agar diffusion법에 따라 생육 저해완의 유무를 관찰하였다(Table 1). 정향 추출물의 경우 40 ㎕/mL의 농도에서 메타 중아황산칼륨는 50 ㎕/mL이상에서 15㎜이상의 clear zone이 형성되었다.
- 항 곰팡이 활성 측정은 배지에 72~84hr 배양한 균주를 2% 취하여 중층용 배지(agar 1.5%)에 분주하여 항 곰팡이 활성검색 배지를 조제 한 후 평판배지에 올려 밀착 시킨 filter paper disc(Ø 8㎜, Advantec, Toyo Roshi Co)에 정향 추출물을 DMSO로 희석하여 농도별로 제조하고 20, 30, 40, 50㎕씩 접종하여 30℃ incubator에 72~84hr 배양한 후 Paper disc agar diffusion법[25]에 준하여 disc 주위에 생성되는 clear zone 직경(㎜)을 측정하였다.
- 항진균성을 나타낸 정향 추출물의 항진균성 물질을 분리할 목적으로 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol을 이용하여 순차적으로 추출하고, 각 추출물의 항진균활성을 검정하였다. 즉, 500 ㎍과 1 ㎎의 추출물을 paper disc에 loading하여 부패 미생물에 대한 항진균활성을 측정한 결과, Fig.
- 항진균성이 높게 나타난 최종 정제된 정향 추출물의 항진균 성분은 EI-MS와 1H(400 MHz), 13C(100 MHz) NMR을 통하여 얻은 화학구조상의 수소 및 탄소골격에 대한 정보를 얻어 활성물질의 구조를 동정하였다. EI-MS은 HewlettPackard 6890 GC을 사용하였고, Column은 HP5-MS(30m×250㎛×0.
대상 데이터
- Column chromatography용 silica gel은 Kieselgel 60(70~230 mesh, Merck, Germany)을 사용하였고, Sephadex LH-20(GE Healthcare, Sweden)을 사용하였다. Thin Layer chromatography (TLC)는 Kiselgel 60 F254s(Merck, German)를 사용하였고, 실험에 사용한 모든 시약은 특급시약을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 균주는 자연계에 널리 분포하여 과채류를 변질·부패 시키는 Penicillium rugullosum IFO 4683 균주로 potato dextrose agar(PDA)에 접종하여 72hr 배양한 후 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 정향(Syzygium aromaticum, Clove)은 2013년 10월에 금산시장의 한약 재료상에서 구입한 후 믹서(FM-680W, HANIL Co., Wom Joo, Korea)로 분쇄 한 후, 40 mesh 체에 내려 폴리에틸렌 백에 넣어 -40℃ deep freezer에 보관하면서 사용하였다. 정향 추출물의 제조는 정향 중량의 10배의 증류수와 99% 에탄올을 가하여 환류냉각기가 장착된 추출기로 비등점에서 4시간 동안 추출하여 Whatman No 2 여과지로 여과한 후 이를 다시 50℃에서 6시간 동안 중탕 하여 동결건조하여 -4℃ 냉동고에 보관하면서 사용하였다.
- 5%)에 분주하여 항 곰팡이 활성검색 배지를 조제 한 후 평판배지에 올려 밀착 시킨 filter paper disc(Ø 8㎜, Advantec, Toyo Roshi Co)에 정향 추출물을 DMSO로 희석하여 농도별로 제조하고 20, 30, 40, 50㎕씩 접종하여 30℃ incubator에 72~84hr 배양한 후 Paper disc agar diffusion법[25]에 준하여 disc 주위에 생성되는 clear zone 직경(㎜)을 측정하였다. 이때 대조구로서는 항진균제인 메타중아황산칼륨과 myconazole을 사용하였다.
성능/효과
- 30 ppm에서 한 개의 methyl proton이 관찰되었다. 13C NMR spectrum을 측정한 결과, 168.9 ppm에서 ester carbonyl carbon, 150.7, 137.8 ppm에서 두 개의 oxygenated sp2 quaternary carbon, 136.9, 122.3, 120.4, 112.5 ppm에서 네 개의 sp2 methine carbon 및 115.9 ppm에서 한 개의 sp2 methylene carbon, 138.8 ppm에서 한 개의 sp2 quaternary carbon이 관찰되었다. 또한, 55.
- H COSY 등의 1차원 및 2차원 NMR spectrum을 측정하여 해석하였다. JH-1화합물을 1H NMR spectrum을 측정한 결과, 6.88 (1H, d, J = 8.3 Hz), 6.71 (2H, 두 피크의 겹침) ppm에서 한 개의 1,2,4-trisubstituted benzene에 기인하는 세 개의 aromatic methine proton과 5.98 (1H, ddt, J = 16.8, 10.0, 6.9 Hz)에서 한 개의 olefinic methine proton, 5.10 (1H, d, J = 16.8 Hz)/5.08 (1H, d, J = 10.0 Hz) ppm에서 한 개의 terminal methylene proton, 3.88 ppm에서 한 개의 methoxy proton, 3.34 (2H, d, J = 6.9 Hz) ppm에서 한개의 methylene proton이 관찰되었다. 또한, 5.
- JH-2-1 화합물을 1H NMR spectrum을 측정한 결과, 6.96 (1H, d, J = 7.6 Hz), 6.80 (1H, d, J = 1.4 Hz), 6.77 (1H, dd, J = 7.6, 1.4 Hz) ppm에서 한 개의 1,2,4-trisubstituted benzene에 기인하는 세 개의 aromatic methine proton과 5.97 (1H, ddt, J = 16.8, 10.0, 6.9 Hz)에서 한 개의 olefinic methine proton, 5.12 (1H, d, J = 16.8 Hz)/5.10 (1H, d, J = 10.0 Hz) ppm에서 한 개의 terminal methylene proton, 3.81 ppm에서 한 개의 methoxy proton, 3.38 (2H, d, J = 6.9 Hz) ppm에서 한개의 methylene proton, 2.30 ppm에서 한 개의 methyl proton이 관찰되었다. 13C NMR spectrum을 측정한 결과, 168.
- JH-2-2 화합물의 화학구조를 규명하기 위해 1H NMR spectrum을 측정한 결과, 7.05 (2H, d, J = 8.6 Hz), 6.77 (2H, d, J = 8.6 Hz) ppm에서 한 개의 1,4-disubstituted benzene에기인하는 aromatic methine proton과 5.94 (1H, ddt, J = 17.2, 10.3, 6.8 Hz)에서 한 개의 olefinic methine proton, 5.05 (1H, d, J = 17.2 Hz)/5.04 (1H, d, J = 10.3 Hz) ppm에서 한 개의 terminal methylene proton, 3.32 (2H, d, J = 6.8 Hz) ppm에서 한 개의 methylene proton 이 관찰되었다. 또한, 4.
- 4 ppm에서 한 개의 methyl carbon이 관찰되었다. 따라서 NMR 분광분석으로부터 본 화합물의 화학구조를 규명하였고 화학구조를 확인하기 위하여 mass 분석을 수행한 결과, m/z 206.1에서 M+ peak가 관찰되어 분자량이 206(C12H14O3)임을 알 수 있었고, 이는 NMR 분광분석에 의하여 결정된 화학구조와 정확히 일치하였다(Fig. 5).
- 8 ppm에서 한 개의 methylene carbon이 관찰되었다. 따라서 이의 확인을 위하여 mass 분석을 수행하였으며 EI-mass spectrum 을 측정한 결과, m/z 164.0에서 M+ peak가 관찰되어 분자량이 164(C10H12O2)임을 알 수 있었고, 이는 NMR 분광분석에 의하여 결정된 화학구조와 정확히 일치하였다(Fig. 4).
- 2에 나타낸 바와 같이 hexane layer에서만 항균활성을 나타내었다. 따라서 정향의 항진균 효과를 추출 용매별로 살펴보면 hexane layer층이 가장 우수한 것으로 나타났고 나머지 용매에서는 항진균 활성이 전혀 없는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 각 용매 분획 시 용매에 따른 항진균성 물질이 용해되어 나타나는 것으로 사료되며 특히, 정향의 항진균 물질은 hexane 분획에서 부패 미생물에 대한 광범위한 clear zone을 형성하는 것으로 보아 항진균 물질은 hexane에 잘 용해되는 물질이고 극성이 비슷한 것으로 생각된다.
- 88 ppm에서 한 개의 hydroxy proton이 관찰되었다. 또한 13C NMR spectrum을 측정한 결과, 153.7 ppm에서 한 개의 oxygenated sp2 quaternary carbon, 129.7, 115.2 ppm에서 1,4-disubstituted benzene에 기인하는 aromatic carbon, 137.8 ppm에서 한 개의 sp2 methine carbon 및 115.5 ppm에서 한 개의 sp2 methylene carbon, 132.3 ppm에서 한 개의 sp2 quaternary carbon이 관찰되었다. 또한, 39.
- 따라서 정향의 항진균 효과를 추출 용매별로 살펴보면 hexane layer층이 가장 우수한 것으로 나타났고 나머지 용매에서는 항진균 활성이 전혀 없는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 각 용매 분획 시 용매에 따른 항진균성 물질이 용해되어 나타나는 것으로 사료되며 특히, 정향의 항진균 물질은 hexane 분획에서 부패 미생물에 대한 광범위한 clear zone을 형성하는 것으로 보아 항진균 물질은 hexane에 잘 용해되는 물질이고 극성이 비슷한 것으로 생각된다.
- 특히, 대조구로 사용된 메타중아황산칼륨의 경우 20 ㎕/mL 농도에서는 생육저지환이 형성되지 않았다. 전반적으로 정향 추출물의 경우 대조구에 비해 항진균성 활성이 우수한 것으로 나타났다.
- 3과 같다. 즉 시료의 양을 0.5 ㎎ 및 1 ㎎으로 하여, 배양 1일과 2일 후에 각각의 저지환을 관찰하였으며 그 결과 화합물 JH-2-2의 항균 활성이 가장 좋았으며, 화합물 JH-1은 JH-2-2 화합물 보다 다소 약하였다. 화합물 JH-2-1은 1 ㎎에서도 약한 활성을 나타내어 분리한 화합물 중에 가장 약한 활성을 나타내었다.
- 항진균성을 나타낸 정향 추출물의 항진균성 물질을 분리할 목적으로 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol을 이용하여 순차적으로 추출하고, 각 추출물의 항진균활성을 검정하였다. 즉, 500 ㎍과 1 ㎎의 추출물을 paper disc에 loading하여 부패 미생물에 대한 항진균활성을 측정한 결과, Fig. 2에 나타낸 바와 같이 hexane layer에서만 항균활성을 나타내었다. 따라서 정향의 항진균 효과를 추출 용매별로 살펴보면 hexane layer층이 가장 우수한 것으로 나타났고 나머지 용매에서는 항진균 활성이 전혀 없는 것으로 나타났다.
- 62 ppm에서 한 개의 hydroxy proton이 관찰되었다. 한편, 13C NMR spectrum을 측정한 결과, 146.4, 143.8 ppm에서 두 개의 oxygenated sp2 quaternary carbon, 137.8, 121.1, 114.2, 111.0 ppm에서 네 개의 sp2 methine carbon 및 115.4 ppm에서 한 개의 sp2 methylene carbon, 131.8 ppm에서 한 개의 sp2 quaternary carbon이 관찰되었다. 또한, 55.
후속연구
- aeruginosa에 대해서 항균효과를 나타내었으며, methanol 추출물의 경우 모든 균에서 항균성을 나타내었다고 보고 하였다[26]. 하지만 기존의 이러한 실험 결과와 다르게 본 실험을 통하여 항균력이외에 정향 추출물 및 그의 hexane 분획물이 항진균활성을 나타내는 것을 확인함으로서 정향의 새로운 용도 개발이라는 측면에서 기대를 할 수 있을 것으로 사료된다.
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