Collagen scaffolds were synthesized by cross linking into a solution mixture of 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochlorid(EDC) in ethanol, followed by pressing, cleaning and lyophilization process after the type I atelo-collagen solutions in D.I water(pH3). The experimental conditi...
Collagen scaffolds were synthesized by cross linking into a solution mixture of 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochlorid(EDC) in ethanol, followed by pressing, cleaning and lyophilization process after the type I atelo-collagen solutions in D.I water(pH3). The experimental conditions are collagen concentration of 1.0 wt%, 3.0 wt%, 5.0 wt% and differential concentration of cross-linker. Then, parametric studies were performed by varying the parameters to investigate the morphology, the porosity, the swelling ratio and the thickness and genotoxicity of the scaffolds. The scaffolds thickness pattern was regular to concentration of the degree of cross-linker and collagen. It was observed that the swelling ratio, the degree of crosslink, and the pore size(thickness of scaffold) can be controlled by adjusting the collagen, crosslinker. Among the parameters investigated, the smallest thickness can be achieved by collagen, crosslinker concentrate condition. The collagen scaffold is induced no genotoxicity. The lowest swelling ratio, as an indication of the highest degree of crosslink, can be obtained by adding crosslink agent.
Collagen scaffolds were synthesized by cross linking into a solution mixture of 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochlorid(EDC) in ethanol, followed by pressing, cleaning and lyophilization process after the type I atelo-collagen solutions in D.I water(pH3). The experimental conditions are collagen concentration of 1.0 wt%, 3.0 wt%, 5.0 wt% and differential concentration of cross-linker. Then, parametric studies were performed by varying the parameters to investigate the morphology, the porosity, the swelling ratio and the thickness and genotoxicity of the scaffolds. The scaffolds thickness pattern was regular to concentration of the degree of cross-linker and collagen. It was observed that the swelling ratio, the degree of crosslink, and the pore size(thickness of scaffold) can be controlled by adjusting the collagen, crosslinker. Among the parameters investigated, the smallest thickness can be achieved by collagen, crosslinker concentrate condition. The collagen scaffold is induced no genotoxicity. The lowest swelling ratio, as an indication of the highest degree of crosslink, can be obtained by adding crosslink agent.
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문제 정의
본 연구에서는 치조골 재생 시 사용되는 치과용 차폐막 개발을 목적으로, 3차원적 다공망 형성과 막 형태의 가공을 시도하기 위해 type I의 atelo-collagen sponge를 용해한 후 동결건조법과 화학적 가교법을 이용하여 콜라겐 지지체를 제조하였다. 예비 실험 단계로서 적절한 팽윤성을 부여하기 위해 각각 다른 농도의 콜라겐과 가교제를 사용하였으며, 제조된 콜라겐 지지체는 생물학적 안전성 평가의 일부로서 유전독성평가를 시행하였으며 약물의 담지 및 원할한 혈행특성을 파악하기 위하여 팽윤실험과, 형태관찰에 대한 물리적 특성 평가를 시행하였다.
제안 방법
Collagen 지지체 4 g당 20 mL의 비율로 멸균생리식염수와 DMSO를 각각 넣고 37 ± 1℃에서 72시간 용출한 후 상층액을 시험액으로, collagen 지지체를 넣지 않은 멸균생리 식염수와 DMSO를 사용하여 동일한 방법으로 처리한 용액을 음성 대조용액으로 사용하였고 sodium azide는 증류수에, 다른 3개의 양성대조군 물질은 DMSO에 용해하여 양성대조 용액으로 사용하였다.
Type1 Atelo-collagen을 각각 1.0 wt%, 3.0 wt%, 5.0 wt%의 농도로 실온에서 용해한 후 동결건조와 성형, 가교, 동결건조의 공정을 거쳐 직경 20 mm, 두께 200~300 μm 의 collagen 지지체를 제작하였다(그림 1).
, USA)하여 지지체를 성형하였다. 가교제로 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochlorid(EDC) (Sigma aldrich, USA)를 ethanol (99.5%, Daejung, Korea)에 0.005 mol%, 0.03 mol%의농도로 분류하여 제조 하였으며 collagen 수용액의 농도에 따라 실험군(표 1)을 나누어 각각 24시간 침지하여 가교를 시행하고 6시간씩 4회를 순수에 세척하였다. 세척이 완료된 collagen 지지체는 다시 예비 냉동 후 동결건조를 시행하여 최종적으로 가압된 디스크 형태의 collagen 지지체를 제작하였다.
, Korea)에서 2시간 예비 냉동을 시행하였다. 냉동된 collagen수용액을 동결건조기(FD-8508, Ilshinbiobase, Co., Ltd., Korea)에서 -86℃, 5 mTorr 조건으로 24시간 동결건조를 시행한 후 건조된 다공성 collagen 지지체를 5ton으로 10분간 일축가압(#3912, Carver INC., USA)하여 지지체를 성형하였다. 가교제로 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochlorid(EDC) (Sigma aldrich, USA)를 ethanol (99.
돼지 피부에서 추출한 type I Atelo-collagen 스펀지 (Bioland, Korea)를 pH3으로 조절된 3차 증류수에 각각 1.0 wt%, 3.0 wt%, 5.0 wt%의 농도로 실온에서 용해한 후 collagen수용액을 미리 준비된 성형 몰드에 분주한 후 -40 ℃의 저온 냉동고(BF-160DFC, Biofree Co.. Ltd., Korea)에서 2시간 예비 냉동을 시행하였다. 냉동된 collagen수용액을 동결건조기(FD-8508, Ilshinbiobase, Co.
본 연구에서는 주성분인 콜라겐의 함량과 가교제의 투여량에 대한 기본적인 조건의 조절에 의해 지지체의 두께, 기공이 한 개의 지지체 내에서 층간 이어지는 복합 3차원 망으로 구성될 수 있는 구조, 주성분의 층간밀도, 지지체의 팽윤성을 조절 할 수 있었다. 또한 이러한 방법에 의해 제조된 지지체에 대하여 체내 이식 후 수개월 또는 십 수개월간 잔류하며 서서히 생분해 되어 체내에 흡수되는 점을 고려하여 가장 장기적인 독성발현을 예측할 수 있는 세대 간독성발현 가능성 및 미생물에 있어서의 돌연변이 유발성 여부를 파악하기 위하여 Salmonella typhimurium의 히스티딘 요구성 균주 TA98, TA100, TA1535, TA1537의 4개 균주와 Escherichia coli의 트립토판 요구성 균주인 WP2uvrA 균주를 이용하여 복귀돌연변이 시험을 실시하였다. 평가결과 사용된 모든 균주에서 복귀돌연변이를 유발하지 않는 것으로 나타났으므로 장기적인 안전성을 확보한 것으로 사료 된다.
본 연구에서 제작된 collagen 지지체는 이식 후 수개월에 걸쳐 체내로 흡수 및 생분해되는 고분자 물질로서 생물학적 안전성 평가를 위해 차기 세대에 영향을 미치는 장기적인 안전성 확보 여부를 확인 할 수 있는 방법 중 하나인 유전 독성평가를 시행하였다.
본 연구에서 제작된 collagen 지지체의 안전성 여부를 확인하기 위하여 유전독성시험 중 미생물 복귀돌연변이 시험을 시행하였다. 대한민국 식약처 의료기기의 용출조건[12]을 기준으로 극성용매와 비극성 용매로 용출하기 위해 음성대조 물질로 멸균생리식염수(Dahan Pharm Co.
03 mol%의농도로 분류하여 제조 하였으며 collagen 수용액의 농도에 따라 실험군(표 1)을 나누어 각각 24시간 침지하여 가교를 시행하고 6시간씩 4회를 순수에 세척하였다. 세척이 완료된 collagen 지지체는 다시 예비 냉동 후 동결건조를 시행하여 최종적으로 가압된 디스크 형태의 collagen 지지체를 제작하였다.
1 mL를, 양성대조군은 양성대조물질용액을 같은 방법으로 실시하였다. 시험액 및 S9 mix의 무균성을 확인하기 위해 시험액 0.1 mL와 S9mix 0.5 mL를 각각 2 mL의 top agar에 혼합하여 플레이트를 제작 하였다. 제작 후 top agar가 응고되면 플레이트를 뒤집어 37℃에서 72시간 배양 후 복귀돌연변이 집락을 계수하였으며 처리군 당 3개의 플레이트를 사용하였다.
본 연구에서는 치조골 재생 시 사용되는 치과용 차폐막 개발을 목적으로, 3차원적 다공망 형성과 막 형태의 가공을 시도하기 위해 type I의 atelo-collagen sponge를 용해한 후 동결건조법과 화학적 가교법을 이용하여 콜라겐 지지체를 제조하였다. 예비 실험 단계로서 적절한 팽윤성을 부여하기 위해 각각 다른 농도의 콜라겐과 가교제를 사용하였으며, 제조된 콜라겐 지지체는 생물학적 안전성 평가의 일부로서 유전독성평가를 시행하였으며 약물의 담지 및 원할한 혈행특성을 파악하기 위하여 팽윤실험과, 형태관찰에 대한 물리적 특성 평가를 시행하였다.
1 mL를 넣고 37℃에서 20분간 120rpm으로 진탕처리 후 top agar를 2 mL씩 분주한 다음 혼합하고 즉시 minimal glucose agar plate 에 부어 전체적으로 퍼지게 하여 응고시켰다. 음성대조군은 시험물질 용액 대신 용매 0.1 mL를, 양성대조군은 양성대조물질용액을 같은 방법으로 실시하였다. 시험액 및 S9 mix의 무균성을 확인하기 위해 시험액 0.
제작된 collagen 지지체는 SEM(S-3000H, Hitachi, Japan)으로 표면 및 단면의 형태, 미세다공층을 관찰하였으며 팽윤실험을 하기위하여 건조된 collagen 지지체의 중량을 측정하고 PBS(NaH2PO4)에 24시간 침지시킨 후 중량을 측정하여 팽윤도를 구하였다. 팽윤도는 다음 식으로 계산 하였다.
대상 데이터
본 연구에서 제작된 collagen 지지체의 안전성 여부를 확인하기 위하여 유전독성시험 중 미생물 복귀돌연변이 시험을 시행하였다. 대한민국 식약처 의료기기의 용출조건[12]을 기준으로 극성용매와 비극성 용매로 용출하기 위해 음성대조 물질로 멸균생리식염수(Dahan Pharm Co. Ltd., Korea)와 dimethyl sulfoxide(DMSO) (Wako Pure Chemical industries, Ltd., Japan)를 사용하였으며 양성대조물질로는 OECD 가이드라인[13-14]에 명기되어 있는 물질인 sodium azide(S9-)와 9-aminoacridine(9-AA), 2-aminoanthracene (2-AA) (Sigma Aldrich, USA), 2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl) acrylamide(AF-2) (Wako Pure Chemical industries, Ltd., Japan)를 사용하였다.
데이터처리
시험결과는 실험군당 3개의 플레이트로부터 얻은 집락 수의 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
이론/모형
Collagen 지지체 4 g당 20 mL의 비율로 멸균생리식염수와 DMSO를 각각 넣고 37 ± 1℃에서 72시간 용출한 후 상층액을 시험액으로, collagen 지지체를 넣지 않은 멸균생리 식염수와 DMSO를 사용하여 동일한 방법으로 처리한 용액을 음성 대조용액으로 사용하였고 sodium azide는 증류수에, 다른 3개의 양성대조군 물질은 DMSO에 용해하여 양성대조 용액으로 사용하였다. 시험액의 처리는 pre-incubation 방법[15]으로 하였다. 건열 멸균한 tube에 시험액 0.
성능/효과
동일한 양의 collagen 수용액과 방법으로 제조한 지지체는 collagen의 함량과 가교제의 농도에 따라 두께의 차이가 수십 μm 였으나 증가 또는 감소의 추이를 나타냈으며 팽윤 도는 유의성 있는 차이로 비례적인 결과가 나타났다.
본 연구에서는 주성분인 콜라겐의 함량과 가교제의 투여량에 대한 기본적인 조건의 조절에 의해 지지체의 두께, 기공이 한 개의 지지체 내에서 층간 이어지는 복합 3차원 망으로 구성될 수 있는 구조, 주성분의 층간밀도, 지지체의 팽윤성을 조절 할 수 있었다. 또한 이러한 방법에 의해 제조된 지지체에 대하여 체내 이식 후 수개월 또는 십 수개월간 잔류하며 서서히 생분해 되어 체내에 흡수되는 점을 고려하여 가장 장기적인 독성발현을 예측할 수 있는 세대 간독성발현 가능성 및 미생물에 있어서의 돌연변이 유발성 여부를 파악하기 위하여 Salmonella typhimurium의 히스티딘 요구성 균주 TA98, TA100, TA1535, TA1537의 4개 균주와 Escherichia coli의 트립토판 요구성 균주인 WP2uvrA 균주를 이용하여 복귀돌연변이 시험을 실시하였다.
시험 결과 용출한 시험액 및 S9mix에 대한 무균시험결과 균의 오염은 관찰되지 않았으며 시험액 처리 시 특이사항은 발견되지 않았다. 본 평가는 극성용매(멸균생리식염수), 비극성용매(DMSO)로 용출한 시험액과 각각의 용매를 이용한 음성대조군 및 양성대조군과 함께 대사활성화법을 적용(S9+) 및 미적용(S9-)으로 시험을 실시하여 대사활성화법 적용의 유무와 관계없이 시험에 사용된 균주인 TA98, TA100, TA1535, TA1537, WP2uvrA에 시험액을 처리한 모든 군에서 복귀돌연변이 콜로니 수는 음성대조군에 비해 증가양상을 나타내지 않았고, 모든 양성대조군에서는 콜로니 수가 음성대조군에 비해 현저한 증가를 나타내었다(표 2).
시험 결과 용출한 시험액 및 S9mix에 대한 무균시험결과 균의 오염은 관찰되지 않았으며 시험액 처리 시 특이사항은 발견되지 않았다. 본 평가는 극성용매(멸균생리식염수), 비극성용매(DMSO)로 용출한 시험액과 각각의 용매를 이용한 음성대조군 및 양성대조군과 함께 대사활성화법을 적용(S9+) 및 미적용(S9-)으로 시험을 실시하여 대사활성화법 적용의 유무와 관계없이 시험에 사용된 균주인 TA98, TA100, TA1535, TA1537, WP2uvrA에 시험액을 처리한 모든 군에서 복귀돌연변이 콜로니 수는 음성대조군에 비해 증가양상을 나타내지 않았고, 모든 양성대조군에서는 콜로니 수가 음성대조군에 비해 현저한 증가를 나타내었다(표 2).
이 결과를 보았을때 본 연구에서 제조된 collagne 지지체의 유전독성에 대하여는 음성인 것으로 나타났다.
후속연구
평가결과 사용된 모든 균주에서 복귀돌연변이를 유발하지 않는 것으로 나타났으므로 장기적인 안전성을 확보한 것으로 사료 된다. 결론적으로 본 연구에서 적용된 실험조건으로 안전성이 확보된 3차원 다공망을 가진 생분해성 천연고분자 지지체는 이후 진행될 후속연구에 대한 콜라겐의 함량과 가교제 투여량의 기초가 될 수 있을 것으로 보이며 속/서방형 약물 전달체, 조직공학용 지지체, 유착방지제에 응용할 수 있을 것이다. 또한 추후에 다양한 조건의 변수 적용과 이식을 통한 장기독성 평가 등의 광범위한 연구가 필요할 것이다.
생분해성 천연고분자의 3차원 다공망 지지체 적용에 있어 약물 담지, 지지체의 체적과 강도, 생분해도 등은 본 연구에서와 같이 주성분의 함량과, 가교제의 농도 이외에도 가교의 방법[20-21], 주성분의 합성[22] 등 많은 방법이 존재한다. 그러나 가장 기본적인 조건 적용에 대한 기초가 마련된다면 더욱 용이한 방법이 제시될 수 있으리라 사료된다.
그러나 교차결합 되지 않은 collagen 지지체의 경우 섬유아세포와의 친화성이 우수하며 본 연구에서와 같이 지지체로서의 역할을 우선한다면 3-D 구조의 기공 세포, 또는 성장인자를 담지[17-18]하는 등의 조직공학적 담체로서의 지지체에서는 오히려 재생효과가 우수하므로 치과용 차폐막으로서의 적용을 위해서는 높은 밀도의 차폐막보다는 지지체 자체의 강도를 개선하고 기능 보완을 위해 기능별 재료에 의한 다층구조의 지지체[19] 형성 등의 방법이 고려되어야 할 것으로 보인다.
결론적으로 본 연구에서 적용된 실험조건으로 안전성이 확보된 3차원 다공망을 가진 생분해성 천연고분자 지지체는 이후 진행될 후속연구에 대한 콜라겐의 함량과 가교제 투여량의 기초가 될 수 있을 것으로 보이며 속/서방형 약물 전달체, 조직공학용 지지체, 유착방지제에 응용할 수 있을 것이다. 또한 추후에 다양한 조건의 변수 적용과 이식을 통한 장기독성 평가 등의 광범위한 연구가 필요할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
생분해성 천연재료를 조직공학적 지지체로 이용하기 위해서 필요한 것은 무엇인가?
대표적인 생분해성 천연재료로는 콜라겐[9], 히알루론산 [10], 키토산[11] 등이 있으며 조직공학적 지지체로 이용하기 위해서는 신생조직이 생착, 성장할 수 있도록 공간을 유지하는 강도와 지지체에 침투된 재생 조직들이 영양소를 공급받으며 성장하도록 기공들이 상호 연결된 다공망의 형성, 조직의 재생과 더불어 서서히 분해되어 최종에는 체내에 남아 있지 않도록 하는 생분해성의 제어가 필요하다.
콜라겐이 조직 공학적 응용 재료로 광범위하게 사용되는 이유는 무엇인가?
콜라겐은 결합조직의 주요구성성분이며 다양한 종류의 동물세포에 대한 천연기질로서 동물조직 내의 다른 단백질에 대하여 비교적 많은 양을 함유하고 있으며 인체를 구성하는 피부, 연골 등에 다량 존재하는 주요 단백질로서 체내 단백질의 약 30%가 콜라겐 구조를 가지고 있다. 기본적인 구조는 tropocollagen으로서 triple chain에 의해 교차결합 되어 있으며 생화학적으로는 세포외부의 간질성분에 존재하는 점액성 물질로 세포 간 접착을 유도하여 연결해주므로 조직 공학적 응용재료로 광범위하게 사용되고 있다.
동종재료이식의 한계점은 무엇인가?
손상된 조직을 대체, 또는 치료하기 위하여 현재 사용되고 있는 재료들은 인간 기증자에 의한 동종재료, 환자 자신의 자가재료, 생물로부터 유래된 생체재료, 인공적으로 제조된 합성재료 등이 있다. 동종재료이식은 제한적인 기증자의 수로 인하여 공급이 매우 부족하고, 자가재료 이식은 공여 부에 대한 2차 치료가 동반되며 채취되는 조직의 양이 한계가 있다. 또한 동물로부터 유래된 이종재료는 질병의 감염 우려와 면역학적 문제가 남게 된다. 따라서 상대적으로 공급이 원활한 인공재료의 개발이 선행되었으며 지금 까지 사용되어온 인공재료들은 손상된 조직을 구조적으로 대체 하거나, 일부기능을 대체하는 수준으로서 생물학적 안전성과 조직학적 생체적합성에 대한 문제가 야기되므로 해결되어야할 과제가 잔류한다.
참고문헌 (22)
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