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문제 정의
- 본 연구는 생분해성 고분자인 PCL을 이용한 다공성 멤브레인을 염출법으로 제조하여 분해성 조절 및 약물담지 효과를 개선하기 위한 초도 연구 수행으로, NaCl을 기공형성체로 이용한 다공성 PCL필름을 제조한 후 다공망 형성 결과관찰 및 기초적인 안전성 확보를 위한 세포 독성평가를 시행하였다.
- 본 연구에서 제작된 다공성 PCL 지지체는 이식 후 수개월에 걸쳐 체내로 흡수 및 생분해되는 고분자 물질로서 다공망 형성을 목적으로 시행된 사전연구임을 고려하여 가장 기초적인 안전성여부를 관찰하기 위해 세포독성 평가를 시행하였다. 시험 결과 세포의 형태적 변화나 용해정도에서 판정기준에 따른 미약함으로 나타났다.
- 본 연구에서는 생분해성 고분자인 PCL을 이용한 다공성 지지체를 염출법으로 제조하여 분해성 조절 및 약물담지 효과를 개선하기 위한 예비연구로서 NaCl을 기공형성체로 이용한 다공성 PCL 필름형 지지체를 제조한후 다공형성결과 관찰 및 기초적인 안전성 확보를 위한 독성평가를 시행하였다.
- 체외(in vitro)세포독성평가는 일반적으로 시험에 대한 접근성이 상대적으로 용이하여 다양한 물질들에 대한 생체적합성 판단을 위한 초기 수단으로 많이 이용되고 있다. 본 평가에서는 다공성 PCL 지지체가 세포의 배양환경 상에서 마우스의 섬유아세포(L-929)에 세포독성을 야기하는지 평가하기 위해 시행되었다. 시험 조건에 따라 다공성 PCL 지지체의 MEM 용출물은 배양배지의 산성도를 변화시키지 않는 것으로 판단되지만 마우스 섬유아세포에 미약한 증식저해를 나타내었다.
- 생분해성 고분자인 PCL을 염출법에 의하여 제조 후 조직공학적 지지체 및 담체를 개발하기 위한 예비연구로서 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
제안 방법
- 24시간 동안 배양하여 단층배양이 된 well을 선택하고 각각의 시험군 및 대조군으로 표기한 이후 배지를 제거한 후 다공성 PCL 지지체의 용출액, 용매대조군, 음성대조군 및 양성대조군을 3개의 선택된 well에 2mL씩 투여하고 (5±1)% CO2, (37±1)℃에서 48시간동안 배양하였다.
- 또한 NaCl 함량별 기공 형성을 관찰하기 위한 실험군은 100㎛미만, 45㎛이상의 크기를 갖는 NaCl을 기공형성체로 사용하여 PCL용액에 10, 30, 50wt%를 각각 혼합하여 실온건조 조건을 시행하였다. NaCl입자 크기별 실험군은 30wt%의 함량을 기준으로 100㎛이상 300㎛, 100 ㎛미만, 45㎛이상, 45㎛미만의 크기로 구성 하였으며 건조조건은 실온이었다.
- PCL의 농도가 낮을수록 용액에 포함되는 CHCl3가 상대적으로 많아지며 다량의 기공이 형성되며 체내 이식후 가수분해에 의한 분해속도가 증가기 때문에 선행 실험을 통해 blade casting이 가능했던 최소량인 5wt%를 설정하였다.
- PCL이 충분히 용해된 것을 확인하고 분급된 NaCl을용해 교반중인 PCL 용액에 혼입시켜 지속적인 교반을 통해 분산시켰으며 분산중인 혼합용액을 정량토출기로 성형판위에 분주하고 캐스팅나이프로 필름형 지지체를 제조하였다.(그림1.
- 건조조건을 수립하기 위한 실험군은 상기한 실험방법과 동일하게 진행되었으며 100㎛미만, 45㎛이상의 크기를 갖는 NaCl을 기공형성체로 사용하여 30wt% 혼합하고 4℃, 실온, 40℃의 조건에서 각각 건조를 시행하였다. 또한 NaCl 함량별 기공 형성을 관찰하기 위한 실험군은 100㎛미만, 45㎛이상의 크기를 갖는 NaCl을 기공형성체로 사용하여 PCL용액에 10, 30, 50wt%를 각각 혼합하여 실온건조 조건을 시행하였다.
- 건조조건을 수립하기 위해 제작된 시료는 100㎛미만, 45㎛이상의 크기를 갖는 NaCl을 기공형성체로 사용하였으며 4℃, 실온, 40℃의 조건에서 각각 건조를 시행하였고 다공형성의 결과는 그림 2와 같다. 4℃ 조건에서 건조된 지지체는 그림2.
- 8%, Sigma Aldrich, USA)를 용매로 미리 건조시켜 수분을 제거한 PCL(polycaprolactone) (Mw: 70,000~90,000, Sigma Aldrich, USA)을 5wt%로 혼합한 후 40℃의 온도를 유지하며 300rpm으로 교반을 통해 용해하여 PCL/CHCl3 혼합용액을 제조하였다. 기공 형성체로 사용할 염화나트륨(NaCl: 99.0%, Daejung, Korea)은 미리 분쇄하여 표준체로 분급 후 100㎛이상 300㎛미만, 45㎛이상 100㎛미만, 45㎛미만의 크기로 분류하였다.
- 건조조건을 수립하기 위한 실험군은 상기한 실험방법과 동일하게 진행되었으며 100㎛미만, 45㎛이상의 크기를 갖는 NaCl을 기공형성체로 사용하여 30wt% 혼합하고 4℃, 실온, 40℃의 조건에서 각각 건조를 시행하였다. 또한 NaCl 함량별 기공 형성을 관찰하기 위한 실험군은 100㎛미만, 45㎛이상의 크기를 갖는 NaCl을 기공형성체로 사용하여 PCL용액에 10, 30, 50wt%를 각각 혼합하여 실온건조 조건을 시행하였다. NaCl입자 크기별 실험군은 30wt%의 함량을 기준으로 100㎛이상 300㎛, 100 ㎛미만, 45㎛이상, 45㎛미만의 크기로 구성 하였으며 건조조건은 실온이었다.
- 24시간 동안 배양하여 단층배양이 된 well을 선택하고 각각의 시험군 및 대조군으로 표기한 이후 배지를 제거한 후 다공성 PCL 지지체의 용출액, 용매대조군, 음성대조군 및 양성대조군을 3개의 선택된 well에 2mL씩 투여하고 (5±1)% CO2, (37±1)℃에서 48시간동안 배양하였다. 배양 후 현미경으로 세포의 용해나 형태를 관찰하였다. 정량분석을 위해 세포의 용해나 현태를 관찰한 후, 트립신을 처리하여 세포를 플레이트에서 분리한 후 각 시험군에서의 생세포를 계수하였다.
- 본 연구에서 제작된 다공성 PCL 지지체의 기초적인 안전성 여부를 확인하기 위하여 생체적합성과 관련된 평가의 초기 수단으로 접근성이 용이한 in vitro 세포독성 평가를 선택하였으며, 세포독성 평가를 위한 시료는 NaCl 크기 100㎛미만, 45㎛이상, 실온건조에 의하여 제조된 지지체에 대하여 γ선 멸균을 시행하였다.
- 성형된 지지체는 건조를 즉시 시행하였으며 건조된 지지체는 성형판에서 분리하여 교반중인 30℃의 증류수에 6시간 동안 침지시키는 방법으로 4회 실시하여 총 24시간 동안 NaCl을 추출한 후 25×25mm의 크기로 재단하여 30분간 신선한 에탄올(95%, Daejung, Korea)에 침지하여 2회, 신선한 증류수에서 30분간 3회 세척을 시행하여 다공성 PCL필름형 지지체 시료를 제작하였다.
- 실험군은 건조조건에 의한 다공망형성, NaCl함량별 다공망형성, NaCl 입자크기별 다공망형성군의 세 가지로 구성하였다.
- 배양 후 현미경으로 세포의 용해나 형태를 관찰하였다. 정량분석을 위해 세포의 용해나 현태를 관찰한 후, 트립신을 처리하여 세포를 플레이트에서 분리한 후 각 시험군에서의 생세포를 계수하였다. 세포독성시험의 최종적 결과 판독은 ISO10993-5[21]에 의해 시행하였다.
- 세포의 배양환경 상에서 마우스의 섬유아세포에 대한 독성을 평가하기 위해 L-929(NCTC Clone 929, ATCC, USA) 세포를 이용하였다. 정성분석을 위해 단층 배양된 세포에 트립신(Trypsin/EDTA)을 처리하여 세포농도가 1mL당 105개가 되도록 조정하고 약 10cm2의 6 well plate(35mm/well)dp 2mL씩 접종하였다. 24시간 동안 배양하여 단층배양이 된 well을 선택하고 각각의 시험군 및 대조군으로 표기한 이후 배지를 제거한 후 다공성 PCL 지지체의 용출액, 용매대조군, 음성대조군 및 양성대조군을 3개의 선택된 well에 2mL씩 투여하고 (5±1)% CO2, (37±1)℃에서 48시간동안 배양하였다.
- 제조된 다공성PCL 필름형 지지체는 주사전자현미경(SEM: S-300H, Hitachi, Japan)으로 표면 다공을 관찰하였다.
- 초기안전성 확인을 위한 평가로는 세포독성평가가 시행되었다. 체외(in vitro)세포독성평가는 일반적으로 시험에 대한 접근성이 상대적으로 용이하여 다양한 물질들에 대한 생체적합성 판단을 위한 초기 수단으로 많이 이용되고 있다.
대상 데이터
- 음성대조군(high density polyethylene film, Hatano research institute, FDSC, Japan) 및 양성 대조군(ZDEC polyurethan film, Hatano research institute, FDSC, Japan)은 1g당 1×MEM 배지 10mL의비율로 37(±1)℃에서 24(±2) 시간 동안 5(±1)% CO2 인큐베이터 내에서 용출하여 24시간 내에 시험에 사용하였다. 세포의 배양환경 상에서 마우스의 섬유아세포에 대한 독성을 평가하기 위해 L-929(NCTC Clone 929, ATCC, USA) 세포를 이용하였다. 정성분석을 위해 단층 배양된 세포에 트립신(Trypsin/EDTA)을 처리하여 세포농도가 1mL당 105개가 되도록 조정하고 약 10cm2의 6 well plate(35mm/well)dp 2mL씩 접종하였다.
- 음성대조군(high density polyethylene film, Hatano research institute, FDSC, Japan) 및 양성 대조군(ZDEC polyurethan film, Hatano research institute, FDSC, Japan)은 1g당 1×MEM 배지 10mL의비율로 37(±1)℃에서 24(±2) 시간 동안 5(±1)% CO2 인큐베이터 내에서 용출하여 24시간 내에 시험에 사용하였다.
- 클로로포름(CHCl 3: >99.8%, Sigma Aldrich, USA)를 용매로 미리 건조시켜 수분을 제거한 PCL(polycaprolactone) (Mw: 70,000~90,000, Sigma Aldrich, USA)을 5wt%로 혼합한 후 40℃의 온도를 유지하며 300rpm으로 교반을 통해 용해하여 PCL/CHCl3 혼합용액을 제조하였다.
이론/모형
- 정량분석을 위해 세포의 용해나 현태를 관찰한 후, 트립신을 처리하여 세포를 플레이트에서 분리한 후 각 시험군에서의 생세포를 계수하였다. 세포독성시험의 최종적 결과 판독은 ISO10993-5[21]에 의해 시행하였다.(Table 1.
성능/효과
- 1. 지지체 성형 후 4℃, 실온, 40℃의 세 가지 건조방법에서는 실온건조 조건에서 가장 우수한 다공형태가 나타났다.
- 2. 기공형성체로 사용된 NaCl의 입자크기에 따른 다공망 형성에 있어서 입자의 크기가 커질수록 macro기공이 형성되었으나 micro 기공은 반비례 하였다.
- 3. 세포독성 시험에서는 ISO10993-5의 기준에 따라 의료용으로서 적합함으로 판단되었다.
- 40℃의 조건에서는 기공이 대부분 붕괴되었으며 PCL이 부분적으로 용해되어 늘어난 형태를 나타내었으며 결과적으로 실온건조조건에서 가장 원형에 가까운 기공이 상호간 연결되는 개기공(open pore)으로 형성되어있는 것을 알 수 있었다.(그림2.
- 건조조건을 수립하기 위한 실험에서는 실온건조가 가장 우수하게 구형에 가까운, 즉 PCL용액에 혼합된 NaCl의 형태를 유지하였고, 4℃건조에서는 기공이 붕괴되어 수직방향에 대하여 납작한 형태가 나타났다.
- 기공 형성체로 사용된 NaCl의 크기별 지지체의 기공은 100㎛≤NaCl<300㎛, 45㎛≤NaCl<100㎛, NaCl<45 ㎛에 대한 각각의 크기에서 모두 균일한 분포를 갖는 macro 기공의 크기가 NaCl의 크기에 비례적으로 형성되었으며 NaCl의 크기가 작아질수록 상대적으로 조밀한 기공이 관찰되었다.
- 기공형성체인 NaCl의 함량별 다공망 관찰결과에서는 함량이 늘어날수록 기공을 이루고 있는 PCL지지 구조에서 더 많은 macro 기공과 micro 기공이 관찰되었으며 이들 macro 기공은 상호 연결된 형태로 다공망을 형성하고 있었다. 또한 macro 기공을 이루고 있는 PCL 지지 구조에서 형성된 micro 기공은 저 함량보다 고 함량에서 많이 형성되어 있었고 비교적 큰 형태를 갖추고 지지구조를 관통하는 기공으로 형성되어 macro기공을 상호간 연결시켜주고 있었다.
- 지지체의 용출물이 투여된 세포에서 배양 후 균일한 단층은 유지되었으나 약 40%의 성장저해가 관찰되어 배양세포에 미약한 반응성이 있는 것으로 나타났다. 또한 생세포의 계수를 통해 정량분석을 실시한 결과 지지체의 용출물이 살아있는 세포수에 미약하게 영향을 미치는 것을 확인 할 수 있었다.(Table 3.
- 본 연구에서 시행된 다공성 PCL 필름형 지지체 제조에서는 NaCl의 크기 및 건조조건의 선택에 따라 기공도 조절을 통해 다공망을 형성시킬 수 있음을 확인하였으며 세포독성평가에서도 시험기준에 적합한 결과로서 성형 및 세척공정에 대한 초기 안전성을 확보했다고 볼 수있다. 이러한 결과는 추후 지속될 조직공학적 지지체 및 담체의 분해성 조절 및 약물 담지 효과의 개선을 위한 후속연구에서 다공망 형성과 조절에 기초기술로 적용될 것이다.
- 본 연구에서 제작된 다공성 PCL 지지체는 이식 후 수개월에 걸쳐 체내로 흡수 및 생분해되는 고분자 물질로서 다공망 형성을 목적으로 시행된 사전연구임을 고려하여 가장 기초적인 안전성여부를 관찰하기 위해 세포독성 평가를 시행하였다. 시험 결과 세포의 형태적 변화나 용해정도에서 판정기준에 따른 미약함으로 나타났다.(Table2.
- 본 평가에서는 다공성 PCL 지지체가 세포의 배양환경 상에서 마우스의 섬유아세포(L-929)에 세포독성을 야기하는지 평가하기 위해 시행되었다. 시험 조건에 따라 다공성 PCL 지지체의 MEM 용출물은 배양배지의 산성도를 변화시키지 않는 것으로 판단되지만 마우스 섬유아세포에 미약한 증식저해를 나타내었다. 그러나 본 평가의 기준으로 설정된 ISO10993-5.
- 이 결과는 다른 조건보다 낮은 온도에 의하여 PCL이 수축되면서 기공의 형태에 영향을 준 것으로 사료되며, 또한 40℃ 조건에서의 건조된 지지체는 기공량이 급격히 감소되었으며 지지체의 구조를 이루고 있는 PCL이 건조조건 온도에 의해 부분적으로 용해된 형태를 취하며 기공이 감소되어 있었다. 이는 PCL의 융점이 60℃임을 고려할 때 매우 얇은 두께의 지지층이 건조 온도에 의해 가열되어 부분적인 표면용해가 발생한 결과 표면에서 기공의 수가 현저하게 줄어들며 내부에 존재하는 CHCl3의 증발을 방해한 것으로 여겨진다.
- 지지체의 용출물이 투여된 세포에서 배양 후 균일한 단층은 유지되었으나 약 40%의 성장저해가 관찰되어 배양세포에 미약한 반응성이 있는 것으로 나타났다. 또한 생세포의 계수를 통해 정량분석을 실시한 결과 지지체의 용출물이 살아있는 세포수에 미약하게 영향을 미치는 것을 확인 할 수 있었다.
후속연구
- 본 연구에서 시행된 다공성 PCL 필름형 지지체 제조에서는 NaCl의 크기 및 건조조건의 선택에 따라 기공도 조절을 통해 다공망을 형성시킬 수 있음을 확인하였으며 세포독성평가에서도 시험기준에 적합한 결과로서 성형 및 세척공정에 대한 초기 안전성을 확보했다고 볼 수있다. 이러한 결과는 추후 지속될 조직공학적 지지체 및 담체의 분해성 조절 및 약물 담지 효과의 개선을 위한 후속연구에서 다공망 형성과 조절에 기초기술로 적용될 것이다.
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