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문제 정의
- 그러나 Polyporus 속의 형질전환에 대한 연구는 보고 된 바가 없으며 먹물버섯과 같은 다른 균류에서 확립된 형질전환법은 겨울우산버섯에 시도하였으나 낮은 원형질체 생성율과 항생제에 대한 민감성 차이로 겨울우산버섯에는 적합하지 않았다. 본 연구에서는 겨울우산버섯의 균사에서 원형질체를 분리하는 조건과 특정 유전자를 도입할 수 있는 형질전환 방법을 확립하였다.
제안 방법
- 현미경을 보면서 hemocytometer로 원형질체를 계수하여 ml당 1 × 107개의 농도가 되도록 STC 완충용액 양을 조절하였다.
- Hygromycin B의 50 µg/ml 이상의 농도에서는 겨울우산버섯의 균사가 전혀 성장하지 못하여(Fig. 1) pBARGPE 벡터가 가지고 있는 bar 유전자를 제거하고 hygromycin B에 저항성을 부여하는 hygromycin B phosphotransferase (hph)유전자를 삽입하여 겨울우산버섯 형질전환용 벡터(pHYgpt)를 제작하였다(Fig. 2).
- 항생제 hygromycinB를 10 µg/ml씩 증가 시켜 10개의 농도별 실험군을 만들어 25‒28℃에서 30일간 겨울우산버섯의 배양 상태를 확인하여 적절한 항생제 농도를 조사하였다.
- 공시균주로 사용된 겨울우산버섯은 국립산림과학원에서 수집하여 보관하고 있는 KFRI 20912 균주를 이용하였다. PDA(potato dextrose agar, DIFCO) 고체배지에서 7일간 28℃에서 배양하여 균사 상태로 유지하였고 액체배양 시 균사가 자란 배지를 멸균된 칼을 이용하여 0.5 cm2 이하로 작게 잘라서 PDB(potato dextrose broth, DIFCO) 액체배지 100 ml에 모두 접종하여 28℃에서 200 rpm으로 진탕하며 배양시켰다. 원형질체 분리를 위해 접종 5일 후 마쇄기로 배양된 균사를 1초씩 5회 마쇄한 다음 20 ml를 취하여 새로운 PDB 100 ml로 옮겨서 5일간 더 배양하였다.
- 겨울우산버섯은 100 µg/ml 이상 높은 농도의 phosphinothricin에서도 균사가 성장하여 선택표지로 bar 유전자가 적합하지 않았다. 이를 대체할 수 있는 항생제로 hygromycin B를 농도별로 CKMM 고체배지에 첨가하여 균사 성장을 조사하였다. 항생제 hygromycinB를 10 µg/ml씩 증가 시켜 10개의 농도별 실험군을 만들어 25‒28℃에서 30일간 겨울우산버섯의 배양 상태를 확인하여 적절한 항생제 농도를 조사하였다.
- PCR 반응을 위해 1 µg의 DNA를 벡터에 존재하는 hph 유전자 부분에서 제작된 forward primer (ATGCC TGAACTCACCGC)와 reverse primer (CAAAGCATCTCATCG)로 Accupower PCR Premix (Bioneer)를 사용하여 PCR 반응하였다.
- 각 균사를 액체질소로 얼려서 막자사발에서 마쇄한 다음 약 100 mg씩 1.5 ml 튜브에 담고 DNA 추출 완충용액(1 M Tris-HCl; pH 8, 5 M NaCl, 0.5 M EDTA; pH 8, 20% SDS)을 300 µl 첨가하여 진탕하였다.
- 원형질체로부터 재생되어 자라는 균사를 형질전환체로 1차 선별하여 멸균된 칼로 0.5 cm2 이하로 잘라서 항생제 농도가 두 배(hygromycin B 100 µg/ml와 ampicillin 100 µg/ml)로 첨가된 CKMM 고체배지에 옮긴 후 다시 배양하며 정상적인 성장을 보이는 균사를 2차 선별하였다(Fig. 3).
- 도입한 벡터가 형질전환체의 염색체 DNA에 안정적으로 삽입되었는지 확인하기 위하여 형질전환체와 wild type의 DNA를 분리하여 PCR을 수행하였다. 각 균사를 액체질소로 얼려서 막자사발에서 마쇄한 다음 약 100 mg씩 1.
- , 2011). 본 실험에서는 형질전환 수율을 높이기 위해 heparin과 ATA 그리고 spermidine을 첨가하였는데 heparin은 벡터의 도입이 원활하도록 원형질체가 응집되는 것을 방지하며, ATA는 외래 유전자를 분해시키는 nuclease의 저해제로 형질전환 과정에서 벡터 DNA가 분해되는 것을 막을 수 있으며, 양이온을 띄는 spermidine은 음이온을 갖는 벡터 DNA를 원형질체 표면으로 붙여주기 때문에 벡터가 세포 내로 삽입되는 효율을 높이는 것으로 알려져 있다(Hallick et al., 1977; Dickman 1988; Li et al., 2006). Li 등(2006)은 느타리버섯의 형질전환에서 이러한 시약을 첨가하여 기존의 방법보다 40배 이상 형질전환 효율을 높여 80–180개/µg DNA의 수율을 얻었는데 겨울우산버섯은 이와 유사한 수율이다.
- 본 연구에서는 백색부후균인 겨울우산버섯의 원형질체 분리 조건과 유전자 형질전환 방법을 확립하였다. 겨울우산버섯 균사에 세포벽 분해효소로 0.
- 5% Usukizyme을 처리하여 ml당 1 × 107개의 원형질체를 확보할 수 있었다. 형질전환체의 선별을 위해 hygromycin에 대한 저항성을 갖는 유전자(hph)를 선택표지로 이용하여 형질전환용 벡터(pHYgpt)를 제작하였다. 40% polyethylene glycol 용액과 aurintricarboxylic acid와 heparin, supermidine을 첨가하여 형질전환을 수행 한 결과 벡터 1 µg 당100–160개의 수율로 형질전환체를 얻었다.
대상 데이터
- 공시균주로 사용된 겨울우산버섯은 국립산림과학원에서 수집하여 보관하고 있는 KFRI 20912 균주를 이용하였다. PDA(potato dextrose agar, DIFCO) 고체배지에서 7일간 28℃에서 배양하여 균사 상태로 유지하였고 액체배양 시 균사가 자란 배지를 멸균된 칼을 이용하여 0.
- 배양된 혼합액을 1 M sorbitol과 항생제(hygromycin B 50 µg/ml, ampicillin 50 µg/ml)가 첨가된 CKMM 상층배지(한천 0.8%)에 현탁시키고 CKMM 고체배지(한천 1.5%)에 도포하여 25℃에서배양하였다.
성능/효과
- 세포벽 분해효소로 Usukizyme을 처리한 후 시간별로 형성된 원형질체 상태와 수를 관찰한 결과 2시간 이하의 짧은 시간에서는 원형질체 수가 ml당 1 × 103개 이하로 너무 적게 형성되고 4시간 이상 길게 반응시키면 세포가 파괴되어 찌꺼기들이 많아지고 원형질체의 안정성이 떨어지는 현상을 보여 3시간 반응이 적절하였다.
- 겨울우산버섯 균사에 세포벽 분해효소로 0.5% Usukizyme을 처리하여 ml당 1 × 107개의 원형질체를 확보할 수 있었다.
- 반응 조건은 1 step, 1 cycle; 94℃, 2분, 2 step, 25 cycle; 94℃, 30초; 60℃, 30초; 72℃, 30초, 3 step, 1 cycle; 72℃, 5분 으로 하였다. 겨울우산버섯의 wild type 균사에서는 PCR 산물이 없으며 항생제 배지에서 선별된 형질전환체의 균사에서는 pHYgpt 벡터의 플라스미드에서 얻어진 PCR 산물과 동일한 크기의 산물을 보여 균사의 염색체 내로 형질전환 벡터가 도입되었음을 확인하였다(Fig. 4).
- 형질전환체의 선별을 위해 hygromycin에 대한 저항성을 갖는 유전자(hph)를 선택표지로 이용하여 형질전환용 벡터(pHYgpt)를 제작하였다. 40% polyethylene glycol 용액과 aurintricarboxylic acid와 heparin, supermidine을 첨가하여 형질전환을 수행 한 결과 벡터 1 µg 당100–160개의 수율로 형질전환체를 얻었다. 도입된 벡터는 hph유전자의 PCR 증폭을 통해 형질전환체의 염색체내에 삽입되었음을 확인하였다.
- 40% polyethylene glycol 용액과 aurintricarboxylic acid와 heparin, supermidine을 첨가하여 형질전환을 수행 한 결과 벡터 1 µg 당100–160개의 수율로 형질전환체를 얻었다. 도입된 벡터는 hph유전자의 PCR 증폭을 통해 형질전환체의 염색체내에 삽입되었음을 확인하였다. 이러한 결과는 polyporus 속의 유전자를 활용한 새로운 균주 개발에 유용한 기술이 될 것이다.
- 4. Confirmation of genomic integration of the vector into the host chromosomal DNA by PCR in the wild type and transformants of P. brumalis (M, molecular weight maker; 1, vector plasmid; 2, wild-type strain; 3-11, transformant).
후속연구
- 본 연구에서 확립된 겨울우산버섯의 원형질체 분리 조건과 형질전환 방법은 Polyporus 속에 포함되는 다른 종에도 적용할 수 있을 것이며 이러한 형질전환 방법은 특정 유전자의 기능 연구와 난분해성 유해물질로 오염된 환경을 정화 할 수 있는 새로운 균주 개발에 유용 할 것으로 사료된다.
- 도입된 벡터는 hph유전자의 PCR 증폭을 통해 형질전환체의 염색체내에 삽입되었음을 확인하였다. 이러한 결과는 polyporus 속의 유전자를 활용한 새로운 균주 개발에 유용한 기술이 될 것이다.
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