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Kafe 바로가기주관연구기관 | 국립축산과학원 National Institute of Animal Science |
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 | 한국어 |
발행년월 | 2016-02 |
과제시작연도 | 2015 |
주관부처 | 농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 | TRKO201600003407 |
과제고유번호 | 1395041232 |
사업명 | 축산시험연구 |
DB 구축일자 | 2016-06-25 |
DOI | https://doi.org/10.23000/TRKO201600003407 |
Ⅳ. 연구개발결과
○ 동결 보호제를 통한 정액의 품질 향상(Glycerol)
제주 흑우의 동결정액 제조시 7%의 glycerol 첨가에서 72.5 ±0.05%의 활력과 43.9 ± 3.33%의 생존율 그리고 35.50 ± 6.84%의 정자막 온전성을 나타내 타 실험구에 비하여 높은 결과를 나타내었다. 또한 정자 첨체막 양상 평가에 있어 7% glycerol 농도에서 수정에 필요한 정자의 비율이 높게 나타났다. 예비동결 조건에 있어 높이와 시간은 정자의 활력, 생존율 그리고 정자막 온전성에 유의적인 영향을 나타내지는 않았으
Ⅳ. 연구개발결과
○ 동결 보호제를 통한 정액의 품질 향상(Glycerol)
제주 흑우의 동결정액 제조시 7%의 glycerol 첨가에서 72.5 ±0.05%의 활력과 43.9 ± 3.33%의 생존율 그리고 35.50 ± 6.84%의 정자막 온전성을 나타내 타 실험구에 비하여 높은 결과를 나타내었다. 또한 정자 첨체막 양상 평가에 있어 7% glycerol 농도에서 수정에 필요한 정자의 비율이 높게 나타났다. 예비동결 조건에 있어 높이와 시간은 정자의 활력, 생존율 그리고 정자막 온전성에 유의적인 영향을 나타내지는 않았으나, 3cm, 5min의 예비동결 조건은 빠른 cooling으로 인한 첨체 손실을 유발하여 조기 첨체반응을 일으키는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 본 연구에서 사용된 glycerol의 농도와 예비동결 결과의 활용으로 희소가축의 생식세포 및 유전자원 보존을 위한 중요한 보존방법이 될 것이며, 생존율과 운동성 증대를 위한 다양한 희석제를 활용한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
○ 동결 보호제를 통한 정액의 품질 향상(Amide 계열)
제주흑우의 정액을 동결 한 결과 glycerol과 DMF를 사용하였을 때 운동성은 64.00 ± 9.62와 59.00 ± 5.48로 DMA와 MF에 비해 유의적으로 높았으며(p<0.05), 생존율 역시 glycerol과 DMF 처리구에서 58.25 ± 6.63과 53.05 ± 3.77로 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). 그러나 glycerol과 DMF 처리구 간의 유의적 차이는 나타나지 않았다. 정자막 온전성 검사(HOST)에 있어서도 역시 glycerol과 DMF 처리에서 정자 미부의 팽창 비율 역시 45.12 ± 25.08과 44.95 ± 8.58로 유의적으로 높았다(p<0.05). 정자의 첨체막 양상 변화에 있어 F pattern의 비율이 MF 처리시 다른 처리구에 비하여 유의적으로 낮았으며(p<0.05), B pattern의 비율은 DMA, DMF 및 MF의 사용시 glycerol에 비하여 유의적으로 증가하였다(p<0.05). AR pattern의 비율에 있어서는 DMF를 제외한 amide의 사용은 F pattern의 감소와 조기 첨체반응에 의한 유의적인 AR pattern의 증가를 볼 수 있었다(p<0.0.5). 그러나 DMF의 사용은 glycerol 보다 AR pattern의 비율이 유의적으로 낮았다(p<0.05). 이러한 결과는 희소 가축의 생식세포 보존 및 유전자원 확립을 위한 중요한 자료가 될 것이며, 제주흑우 및 희소 가축의 안정적이고 효율적인 동결 정액 제조 연구에 있어 중요한 정보를 제공할 것으로 평가된다.
○ 동결 보호제를 통한 정액의 품질 향상(Low Density Lipoproteins
제주흑우의 정액 동결 시 LDL, LDL-taurine, LDL- hypotaurine 그리고 LDL-trehalose 의 첨가는 (63.40 %± 7.39, 69.70%±6.12, 67.25%±3.21, 64.55%±2.43) 대조구에 (56.25%±6.42) 비하여 모두 유의적인 생존율의 증가를 나타냈다 (p<0.05). 정자막 온전성 검사를 통한 꼬리막 팽창 정자의 비율은 LDL-taurine을 첨가 실험구에서 70.55 %± 5.16, LDL-hypotaurine 첨가 실험구에서 64.45%±5.85, LDL- trehalose 실험구에서 64.50%±2.78, LDL 단독 첨가 실험구에서 61.65%±5.18로 대조구 51.90%±9.99보다 모두 유의적으로 높은 결과를 나타냈다 (p<0.05). 동결 융해 후 정자의 첨체막 변화 양상에 있어서는 B pattern의 비율은 대조구와 실험구 모두 유의적 차이가 없었으며, F pattern은 LDL-taurine의 조합만이 대조구와 유의적인 차이를 나타내며 증가하였다 (p<0.05). 그러나 AR pattern의 비율은 LDL-taurine, LDL-trehalose, LDL-hypotaurine 그리고 LDL 처리의 순으로 대조구에 비하여 모두 유의적으로 낮은 수준의 AR pattern의 비율을 나타냈다(p<0.05). 정자의 수정능력 평가에 있어 LDL-taurine, LDL-hypotaurine 그리고 LDL-trehalose 모두 대조구에 대하여 유의적으로 높은 웅성전핵 형성율과 SFI를 나타냈으며 (p< 0.05), 특히 LDL-taurine의 첨가는 LDL의 단독 처리에 비하여도 유의적으로 높은 수준의 웅성전핵 형성율과 SFI를 나타냈다 (p<0.05). 또한, decondenced sperm 비율에 있어 LDL, LDL-taurine, LDL-hypotaurine 그리고 LDL-trehalose 실험구 모두 대조구에 비하여 유의적으로 높은 결과를 나타냈다 (p<0.05). 본 연구의 결과는 제주흑우 정액의 동결정액 제조에 있어 안정적인 제조법을 공급할 수 있으며, 동결 융해 후 정자의 기능 개선 방법에 보다 많은 정보를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.
○ 동결 보호제를 통한 정액의 품질 향상(Taurine, Taurine과 hypotaurine)
Taurine, Taurine과 hypotaurine의 첨가는 유의적으로 높은 운동성, 생존성을 보였으며 (p<0.05), 특히 hypotaurine은 다른 실험구에 비하여 유의적으로 높은 정자막 온전성을 나타냈다(p<0.05). 뿐만 아니라, hypotaurine은 유의적으로 높은 F pattern 비율을 유지하였으며 (p<0.05), 이들 항산화물질을 첨가한 실험구에서는 대조구에 비하여 유의적으로 낮은 AR pattern을 나타내어(p<0.05) 동결로 기인된 수정능획득 유사 상태 정자의 비율을 유의적으로 감소시켜 조기 첨체반응 비율을 감소시켰다. 정자의 난자내 침투능력에 있어서 모든 처리구에서 대조구보다 높은 웅성전핵 형성율과 SFI를 나타냈으며, hypotaurine의 처리는 가장 높은 침투능력을 나타냈으나 처리구간의 유의적 차이는 나타나지 않았다. 본 연구결과는 멸실위험의 토종가축 생식세포 및 유전자원 보존과 토종가축 육성을 위한 번식 증대를 위한 제주흑우 동결정액 제조에 중요한 이용 방법이 될 것이며, 동결 융해 후 정자의 기능 개선을 위한 다양한 희석제 및 첨가제를 활용한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
○ 동결 보호제를 통한 정액의 품질 향상(Ethylene glycol)
제주흑우의 동결정액 제조시 5%의 ethylene glycol의 첨가가 72.5 ± 5.00%의 활력과 54.88 ± 0.66%의 생존율 그리고 46.00 ± 2.40%의 정자막 온전성을 나타내 3%와 5%의 ethylene glycol을 첨가한 실험구보다 유의적으로 높은 결과를 나타냈다(p<0.05). 또한 7% glycerol을 사용한 실험구와 비교하였을 때 5% ethylene glycol을 첨가하였을 때 유의적으로 높은 생존율과 정자막 온전성을 나타냈다(p<0.05). 또한 예비 동결 조건이 정자의 성상에 미치는 영향에 있어서는 3cm, 5분 예비동결 실험구에서 생존율과 정자막 온전성이 유의적으로 감소하였다(p<0.05). Ethylene glycol이 정자의 첨체 양상에 미치는 영향에 있어서는 5%와 7%의 ethylene glycol을 사용하였을 때 효과적으로 첨체가 보호되어 F pattern의 비율이 유의적으로 높게 나타났으며(p<0.05), 조기 첨체반응도 유의적으로 낮은 수준을 보였다(p<0.05). 그러나 7%의 glycerol과 비교 하였을 때는 유의적인 차이를 나타내지 않았으며 5%와 7% ethylene glycol 사이의 유의적 차이도 나타나지 않았다. 예비 동결 조건이 정자의 첨체 양상에 미치는 영향에 있어서는 역시 정자의 생존율과 정자막 온전성과 같이 3cm, 5분 예비동결 시 유의적인 F pattern의 감소와 조기 첨체반응에 의한 AR pattern의 증가를 볼 수 있었다(p<0,05). 이와같은 결과는 본 연구에서 사용된 ethylene glycol과 예비동결 조건의 조합으로 나타난 결과를 활용하여 희소가축의 생식세포 보존 및 유전자원 확립을 위한 중요한 자료가 될 것이며, 생존율과 운동성 증대를 위한 다양한 희석제를 활용한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
○ 씨수소의 운동을 실시한 후 정액품질 향상 효과
씨수소의 운동량에 관한 결과에 있어서, 횡와(앉음)상태 및 운동상태의 비율은 횡와 (앉음)상태가 5.7%, 운동상태가 94.3%로 <로프 고정장치>를 적용함으로써 소의 운동상태가 크게 많아졌다. 씨수소의 정액 성상에 관한 결과에 있어서, 운동을 함으로써 정자의 생존율이 크게 향상(89.3%)되었고, 운동을 함으로써 정자의 직진운동 비율이 크게 향상(97.1%)되었다. 씨 수소의 성적 반응에 관한 결과에 있어서, 운동을 함으로써 암소에 승가하는 시간이 크게 단축 (1분 02초)되었고, 운동을 함으로써 채정까지의 시간이 크게 단축(2분 06초)되었으며, 운동을함으로써 Libido Score(성욕지수)가 크게 높아(4.43)졌다. 또한 운동을 함으로써 채정이 되는데까지의 승가 횟수(30분 이내)가 크게 줄어들었고(1.71회), 운동 기간별 Testosterone수준이 대조구(운동을 하지 않은 경우)는 기간의 경과에 따라 혈중 Testosterone수준에 변화가 없었으나, 운동구의 경우 운동 후 30일에 혈중 Testosterone수준이 상당한 정도로 높아졌다.
○ Adipocye determination and differentiation factor-1(ADD1) 유전자의 발굴 및 활용
한우와 제주흑우실용화축군(JBC-DC) 집단에서 ADD1 유전자의 유전적 다형성을 조사하였다. ADD1 유전자형은 intron 7 영역에서 84-bp 절편의 유무에 따라 결정하였다. 두 집단에서 ADD1 유전자형과 도체형질의 상관관계를 시험하였다. 한우 거세우집단에서는 ADD1 D/-도체들이 WW 개체들보다 유의적으로 더 두꺼운 등지방두께를 보여주었다(P<0.05). 하지만, JBC-DC 집단에서는 이형접합인 WD에서 가장 두꺼운 등지방두께를 나타냄을 볼 수 있었고 (P<0.05), 이는 W와 D 대립인자의 상승효과에 의해 등지방 축적이 증가하는 것으로 추정된다. 반면 육질등급지수나 근내지방도으로 측정된 근육조직에서 근내지방의 축적과 ADD1 유전자형과는 상관없는 것으로 조사되었다.
이러한 발견들은 ADD1 유전자형이 유전적 분자 마커로써 한우와 제주흑우-유래의 고배육성 체계의 개량을 위해서 효과적인 역할을 수행할 수 있음을 보여주는 결과이다.
1. This study was carried out to establish most suitable freezing condition, to evaluate the different glycerol concentration of freezing and thawing rates on motility, viability, membrane integrity and acrosome intecrity of frozen Korean Jeju Black Bull spermatozoa. Semen was collected from a Korea
1. This study was carried out to establish most suitable freezing condition, to evaluate the different glycerol concentration of freezing and thawing rates on motility, viability, membrane integrity and acrosome intecrity of frozen Korean Jeju Black Bull spermatozoa. Semen was collected from a Korean Jeju Black Bull using an artificial vagina and transported to the laboratory. The semen was extended gradually 1:5 then cooled slowly for 2 hrs to 4ºC. The semen was diluted 1:1 with cryoprotectant extenders (3%, 5% and 7% glycerol) and equilibrated for 2 hrs at cold chamber and packed to 0.5 ml straws. The semen straws were located above 3 cm of liquid nitrogen for 5minutes, above 5 cm for 10 min and above 8 cm for 10 min. And then the frozen straw was plunged into LN2. The presented straws were examined the viability and motility after thawed at 37ºC waterbath. The viability and membrane integrity immediately post-thawing were significantly higher in samples frozen in 7% glycerol than 3% and 5% glycerol(p<0.05). After CTC staining to assess acrosome integrity, F pattern was significantly increased, but B pattern was significantly decreased in 7% glycerol(p<0.05). Freezing distance of 5cm from liquid nitrogen and pre-cooling for 10min yield better survival and membrane integrity, but notsignificant difference. However, AR pattern according to CTC staining was significantly decreased in 3cm for 5min.
2. The objective of this study was to examine effect of ethylene glycol for semen cryopreservation in Korean Jeju Black Bull. The semen was cryopreserved with extenders containing cryoprotectants (7% glycerol and 3%, 5%, 7% ethylene glycol) and packed to 0.5 ml straws. The semen straws were located above 3 cm of liquid nitrogen for 5min, 5 cm for 10 min and 8 cm for 10 min. And then frozen straw was plunged into LN2.Post-thawedspermmotility,viabilityandmembraneintegrityweresignificantlyhigherin5%ethyl eneglycol(72.5± 5.00%, 54.88 ± 0.66% and 46.00 ± 2.40%; p<0.05). Motility and viability were similar between 7% glycerol and 5% ethylene glycol. However, the membrane integrity was significantly higher in 5% ethylene glycol (34.69 ± 4.64% vs 46.00 ± 2.40%; p<0.05). The viability and membrane integrity were significantly higher in 5cm for 10 min and 8cm for 10 min than 3cm for 5min (viability: 55.81 ± 2.94, 55.19 ± 3.34vs 47.94 ± 3.48%; p<0.05 and membrane integrity: 44.94 ± 3.51, 46.06 ± 2.25 vs 40.38 ± 1.03%; p<0.05). The percentage of capacitated sperm assessed by CTC staining, percentage of F pattern was higher in 7% glycerol, 5% and 7% ethylene glycol, and AR pattern was significantly higher in 3% ethylene glycol. F pattern was significantly increased in 5 cm for 10 min and 8 cm for 10 min (p<0.05), but AR pattern was significantly increased in 3cm for 5 min (p<0.05).
3. The objective of this study was to examine the effect of amides as a cryoprotectant for semen cryopreservation in Korean Jeju Black Bull. The semen was cryopreserved with extenders containing 5% dimethyl acetamide (DMA), 5% dimethyl formamide (DMF), 5% methyl formamide (MF) or 7% glycerol. Post-thawed sperm were evaluated for sperm motility, viability, acrosome integrity and membrane integrity. Post-thawed sperm motility was significantly higher (p<0.05) in glycerol and DMF (64.00% ± 9.62 and 59.00% ± 5.48, respectively) than DMA and MF (50.00% ± 3.24 and 44.00% ± 4.18, respectively). Sperm viability was significantly higher (p<0.05) in glycerol and DMF (58.25% ± 7.35 and 53.05% ± 3.77, respectively) than others. However, for sperm motility and viability, there were no differences among glycerol and DMF. Also, swelling sperm ratio by hypo-osmetic selling test (HOST) was significantly increased (p<0.05) in glycerol and DMF treatments (45.12% ± 25.08 and 44.95% ± 8.58, respectively). The percentage of capacitated sperm assessed by CTC staining, F pattern was lower (p<0.05) in DMF than others. B pattern was increased (p<0.05) in DMA, DMF and MF when compared with glycerol. AR pattern ratio was decreased (p<0.05) in glycerol and DMF when compared with DMA and MF. These results suggested that amides performed better and could be used as a cryoprotectant for semen freezing of Korean Jeju Black Bull.
4. This study was designed to determine whether low-density lipoproteins (LDL) from egg yolk and taurine, hypotaurine and trehalose as antioxidant in extender improve the freezability and fertility of Korean Jeju Black Bull semen. The semen was cryopreserved with tris egg yolk extenders containing 7% glycerol and treated 4% LDL, 20 mM taurine, hypotaurine and trehalose. Frozen-thawed sperm were evaluated motility, viability, membrane, and acrosome integrity and sperm penetration ability. The results were compared to semen cryopreserved in tris egg yolk extender only as control. Frozen-thawed semen evaluation cleary indicated that the addition of LDL and LDL-antioxidants (taurine, hypotaurine and trehalose) combination were significantly improved (p<0.05) the viability (%; with staining test using eosin-Y) compared to control spermatozoa. Also, in membrane integrity (%; with supravital hypo-osmotic swelling test), not only LDL-antioxiants combination but also LDL were significantly increased (p<0.05) the swelled sperm using HOST compared to control. Sperm acrosome integrity state was classified by CTC (chlortetracycline) staining test. F pattern was significantly increased in LDL-antioxidant combination than control (p<0.05) and B pattern was not significantly differences among all treatments and control. However, AR pattern was significantly decreased in LDL-antioxidants combination than control (p<0.05). Pronucleus formation and sperm penetration index (SFI) were significantly increased in LDL and LDL-antioxidants combination than control (p<0.05). Especially, LDL-taurine significantly improved pronucleus fomation and SFI than LDL (p<0.05). It was concluded that LDL and LDL-anti- oxidants in extender improved the freezability and fertility of Korean Jeju Black bull spermatozoa.
5. Cryopreservation induces sublethal damage to the spermatozoa, which leads to their reduced fertile life. The objective of this study was to investigate the effect of taurine, hypotaurine and trehalose as antioxidants on the function of the freezing-thawed sperm in Korean Jeju Black Bull. The semen was cryopreserved with tris egg yolk extendercontaining 7% glycerol and treated with 20mM taurine, hypotaurine and trehalose. Frozen-thawed sperms were evaluated for sperm motility, viability, membrane integrity, acrosome integrity and sperm penetration ability. The results were compared to semen cryopreserved in tris egg yolk extender containing 7% glycerol only as control. Frozen-thawed semen evaluation clearlyindicated that the addition of taurine or hypotaurine significantly improved (p<0.05) the motility and viability compared to control spermatozoa. Moreover, in membrane integrity, swollen sperm ratio was significantly increased (p<0.05) in taurine, hypotaurine or trehalose compared to control. In sperm acrosome integrity, F pattern ratio was increased (p<0.05) in hypotaurine among treatments, and AR pattern was significantly lowered (p<0.05) in taurine, hypotaurine and trehalose. In assessed sperm fertilizing ability, taurine, hypotaurine or trehalose significantly improved (p<0.05) the ratio of pronucleus formation and SFI. Finally, compared with the control, addition of taurine, hypotaurine or trehalose as an antioxidant to the freezing extender showed more positive effects on the frozen-thawed spermatozoa. It is concluded that the addition of taurine, hypotaurine, or trehalose to the freezing extender could reduce cryodamage of the Korean Jeju Black Bull spermatozoa.
6. The objective of this study was to examine Effects of Exercise on Sperm Quality and Libido of Stud Bulls. Regular exercise and physical activity is very important to stay healthy in domestic animals. But excessive exercise can affect reproduction of bull. Therefore proper exercise is a good influence in semen quality of bulls for semen collection. Stud bulls for semen collection exercise in grazing area or playground from 10 a.m. to 17 p.m. every 2-3days during 27days. The grazing behavior of stud bulls in grazing area or playground were 5.7% in lying on one's side and 94.3% in exercise. The survival rate of sperm in stud bulls were 89.3% and libido score was increased in exercise group. The Testosterone (T2) content was increased (12.81±1.09ng/ml in 0day, 14.01±0.78ng/ml in 30days) in exercise group compare to control group.
7. Genetic polymorphisms of adipocyte determination and differentiation factor 1 (ADD1) gene were screened in Hanwoo and Jeju Black cattle-derived commercial (JBC-DC) populations. The ADD1 genotypes were determined using the presence/absence of 84-bp fragment at intron 7 region. The association of ADD1 genotypes for carcass traits was examined in both populations. In the Hanwoo steers, ADD1 D/- carcasses showed significantly thicker backfat levels than those from WW (P<0.05). However, the thickest level of backfat thickness was appeared in WD heterozygotes but not in DD homozygotes in the JBC-DC population (P<0.05), estimating that synergic effects of alleles W and D increase backfat deposition. On the other hand, there was no association between the ADD1 genotypes and intramuscular fat deposition measured as meat quality index and marbling score as well. From these results, we estimated that the bovine ADD1 affected the backfat at subcutaneous tissue rather than intramuscular fat at muscle tissue. In addition, the DD animals showed higher levels of meat color than those from W/-(P<0.05). Interestingly, the highly significant difference was found between the genotypes and carcass weights only in JBC-DC population and D/- animals were heavier over 38kg than those from WW (P<0.001). The results of this study reveal faster growth rate and differences in steer productivity according to genotypes of the ADD1 gene. These findings demonstrate that ADD1 genotypes may effectively function as molecular genetic markers for the improvement of Hanwoo and Jeju Black cattle-related crossbreeding systems.
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