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문제 정의
- 본 연구는 최근 북한강 수계에서 번성하고 있는 Anabaena strain의 16S rDNA 염기서열을 이용한 종 수준의 동정과 geosmin 합성 유전자의 탐침을 통해 이취미 물질의 잠재 생산능력을 분석하였다. 현장(경기도 양평군 조암면 삼봉리 수역)에서 분리 배양한 Anabaena는 직선형과 나선형 두 가지의 형태적 변이를 보였다.
- 본 연구에서는 북한강 수역에서 geosmin 농도가 급증한 시기 동안에 우점하였던 Anabaena strais의 분자적 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열을 이용한 계통수 및 유연관계 분석을 수행하였으며, geosmin 생산 잠재성을 유전자 수준에서 분석하였다.
- 또한 직선형과 나선형 strain 모두에서 geosmin을 합성하는 유전자 구간이 발견되어, 북한강 수계에 존재하는 Anabaena circinalis는 종의 형태적 변이에 관계없이 geosmin을 생산할 수 있음을 보여주었다. 본 연구의 결과는 유전자 수준에서 A. circinalis의 geosmin 생산에 대한 직접적인 증거를 제공하는 국내 최초의 보고로서 북한강 수계에서 geosmin 증가의 원인종 확인 및 관리에 중요한 자료를 제공한다.
제안 방법
- Genomic DNA extraction kit (Macherey-Nagal, USA)를 사용하여 배양된 세포의 DNA를 추출하였으며, 각각의 시료는 lysis 용액 및 silica bead와 함께 vortexing하여 세포를 파괴하였다. 용출된 세포혼합액 700 μL를 microcolumn의 resin에 옮겨 담고 원심분리하여 DNA만 흡착∙분리하였다.
- 두 가지 strain의 A. circinalis의 geosmin 생산 잠재성을 유전자 수준에서 판단하기 위해 세포의 DNA에서 geosmin 형성 유전자 증폭을 수행하였다. 증폭된 산물을전기영동으로 분석한 결과, 두 가지 형태 모두에서 565 bp 크기의 유전자 염기서열이 100% 일치하는 band가 나타났다(Table 2).
- 북한강에서 분리된 Anabaena의 DNA를 이용하여 geosmin 생산능력을 유전자 수준에서 판단하였다. 실험에 사용된 primer는 3139F (CTAGACCMATGCGGGTTT TA)와 3708R (CCATTC-TTTRGAATGMTT)이었으며, 이는 Phormidium sp.
- 북한강에서 분리한 Anabaena의 유전자 염기서열의 특징을 조사하기 위해 추출된 DNA를 이용하여 16S rRNA를 PCR 증폭하였다. 유전자 비교를 위해 NCBI에서 Anabaena strain의 16S rRNA유전자 염기서열 자료를 내려 받았으며, 1000 bp~1400 bp의 크기의 유전자 자료만을 선별하여 64개의 Anabaena strain의 16S rRNA 유전자 자료를 선택하였다.
- 용출된 세포혼합액 700 μL를 microcolumn의 resin에 옮겨 담고 원심분리하여 DNA만 흡착∙분리하였다. 분리된 Anabaena의 정확한 종 단위 검증을 위하여 16S rRNA 유전자를 PCR 증폭하였다. 이를 위해 CYA106F (GGG GAA TTT TCC GCA ATG GG) (Nübel et al.
- 증폭된 유전자는 ABI 3730XL DNA analyzer (Perkin-Elmer, USA)를 이용하여 유전자 염기서열을 분석하였다(SolGent, Korea). 유전자 염기서열 분석을 위해 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분의 온도 변화를 30회 반복하여 매회 발생하는 형광값을 분석하였다. 분석을 통해 확인된 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA) Genbank database의 BLAST program을 이용하여 상동성(Homology) 분석을 수행하였다.
- 유전자 증폭은 ABI BigDye® Terminator v3.1 CycleSequencing kit를 이용하여 형광물질을 산물에 부착하여, 다시 증폭과정을 수행하였다.
- 이를 위해 CYA106F (GGG GAA TTT TCC GCA ATG GG) (Nübel et al., 1997)와 1492R (ACC TTG TTA CGA CTT) (Lane et al., 1985) primer를 사용하였으며, 95℃에서 2분 동안 처리한 후 95℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 90초의 순으로 35회 반복한 뒤, 72℃에서 5분 동안 처리하여 유전자를 증폭하였다.
- PCR 증폭을 위해 95℃에서 2분간 처리 후, 95℃ 30초, 53℃ 30초, 72℃ 1분을 30회 반복한 뒤, 72℃ 10분 처리하였다. 증폭된 PCR 산물은 Ethidium bromide와 TAE buffer를 혼합한 1% agarose gel에서 전기영동하여 크기를 측정하였으며, NCBI에서 BLAST를 통해 Genbank database의 유전자와 비교하여 geosmin 생산 유전자를 확인하였다.
- 1 CycleSequencing kit를 이용하여 형광물질을 산물에 부착하여, 다시 증폭과정을 수행하였다. 증폭된 유전자는 ABI 3730XL DNA analyzer (Perkin-Elmer, USA)를 이용하여 유전자 염기서열을 분석하였다(SolGent, Korea). 유전자 염기서열 분석을 위해 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분의 온도 변화를 30회 반복하여 매회 발생하는 형광값을 분석하였다.
- 최종적으로 현장에서 가장 많이 관찰된 직선형(straight-type)과 나선형(coil-type) 두 가지 형태의 Anabaena strain을 분리하였다. 현미경(ZEISS, axiovert, Germany)을 통해 세포의 형태적인 특징을 사진기(Canon 650D, Japan)로 촬영한 후 INNERVIEW v2.0 program (ZOOTOS, Korea)을 이용하여 세포의 크기 및 길이를 측정하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 primer는 3139F (CTAGACCMATGCGGGTTT TA)와 3708R (CCATTC-TTTRGAATGMTT)이었으며, 이는 Phormidium sp. P2r sesquiterpene synthase (geoA2)와 Anabaena ucrainica CHAB2155 putative geosmin synthase (gys1) 유전자 정보를 이용하여 제작하였다 (Ludwig et al., 2007; Tsao et al., 2014). PCR 증폭을 위해 95℃에서 2분간 처리 후, 95℃ 30초, 53℃ 30초, 72℃ 1분을 30회 반복한 뒤, 72℃ 10분 처리하였다.
- 북한강에서 분리한 직선형과 나선형 Anabaena의 16S rDNA 유전자 정보를 DDBJ (DNA Database Bank of Japan)에 등록하였으며, Accession 번호 LC006113, LC 006112를 각각 부여받았다.
- 북한강에서 분리한 Anabaena의 유전자 염기서열의 특징을 조사하기 위해 추출된 DNA를 이용하여 16S rRNA를 PCR 증폭하였다. 유전자 비교를 위해 NCBI에서 Anabaena strain의 16S rRNA유전자 염기서열 자료를 내려 받았으며, 1000 bp~1400 bp의 크기의 유전자 자료만을 선별하여 64개의 Anabaena strain의 16S rRNA 유전자 자료를 선택하였다. 염기서열의 계통수 분석을 위해 유전자는 Clustal W algorithm을 통해 정렬하였으며 Maximum parsimony (MP) 방법, Maximum likelihood (ML) 방법, Neighbor-joining (NJ) 방법을 이용하여 수행하였다.
데이터처리
- 염기서열의 계통수 분석을 위해 유전자는 Clustal W algorithm을 통해 정렬하였으며 Maximum parsimony (MP) 방법, Maximum likelihood (ML) 방법, Neighbor-joining (NJ) 방법을 이용하여 수행하였다. MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013)을 이용하여 분석을 수행하였으며, 계통수의 확실성 평가를 위한 bootstrap (BS)은 모든 방법에서 1000회 반복하였다. Maximum likelihood 방법과 Neighbor-joining 방법에서 염기서열의 치환모델은 각각 Tamura-Nei (Tamura and Nei, 1993)와 Maximum composite Likelihood (Felsenstein, 1985) 모델을 사용하였으며, Maximum parsimony 방법은 MrModeltest v2.
- 유전자 염기서열 분석을 위해 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분의 온도 변화를 30회 반복하여 매회 발생하는 형광값을 분석하였다. 분석을 통해 확인된 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA) Genbank database의 BLAST program을 이용하여 상동성(Homology) 분석을 수행하였다. 각 균주의 염기서열은 Clustal W algorithm을 이용하여 병렬로 정렬하였으며, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 비교 분석결과에서 hit score가 가장 높은 종으로 동정하였다.
이론/모형
- Anabaena가 대발생한 2012년 8월에 북한강 수역의 조안면 삼봉리 지역(37°34′59.6′′N, 127°20′12.2′′E)에서 현장수를 채수하여 실험실로 저온 운반하였으며, Capillary method (Guillard, 1973)를 이용하여 단일 세포를 분리하였다.
- , 2013)을 이용하여 분석을 수행하였으며, 계통수의 확실성 평가를 위한 bootstrap (BS)은 모든 방법에서 1000회 반복하였다. Maximum likelihood 방법과 Neighbor-joining 방법에서 염기서열의 치환모델은 각각 Tamura-Nei (Tamura and Nei, 1993)와 Maximum composite Likelihood (Felsenstein, 1985) 모델을 사용하였으며, Maximum parsimony 방법은 MrModeltest v2.3 (Nylander, 2004)에 따라 GTR+I+G 모델을 사용하였다.
- 유전자 비교를 위해 NCBI에서 Anabaena strain의 16S rRNA유전자 염기서열 자료를 내려 받았으며, 1000 bp~1400 bp의 크기의 유전자 자료만을 선별하여 64개의 Anabaena strain의 16S rRNA 유전자 자료를 선택하였다. 염기서열의 계통수 분석을 위해 유전자는 Clustal W algorithm을 통해 정렬하였으며 Maximum parsimony (MP) 방법, Maximum likelihood (ML) 방법, Neighbor-joining (NJ) 방법을 이용하여 수행하였다. MEGA 6.
성능/효과
- 2). NCBI의 유전자 은행으로부터 선별한 1000 bp에서 1400 bp 길이의 Anabaena strain과의 BLAST 분석 결과에서도 두 strain 모두 일본에서 분리된 Anabaena circinalis TAC strain과 98%의 유전적 유사도를 나타내었다. 이와 같은 결과는 북한강에서 발생한 두 가지 형태의 Anabaena strain이 종 수준에서 동일함을 보여준다.
- 분석을 통해 확인된 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA) Genbank database의 BLAST program을 이용하여 상동성(Homology) 분석을 수행하였다. 각 균주의 염기서열은 Clustal W algorithm을 이용하여 병렬로 정렬하였으며, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 비교 분석결과에서 hit score가 가장 높은 종으로 동정하였다.
- crassa와 유사한 형태적 특징들을 보여주었다. 그러나 16S rDNA 계통수 및 유연관계를 분석한 결과, 직선형과 나선형 모두 동일한 A. circinalis 종으로 확인되었다(98%~100%의 유전적 유사도). 또한 직선형과 나선형 strain 모두에서 geosmin을 합성하는 유전자 구간이 발견되어, 북한강 수계에 존재하는 Anabaena circinalis는 종의 형태적 변이에 관계없이 geosmin을 생산할 수 있음을 보여주었다.
- 나선형 Anabaena의 영양세포는 직선형과 마찬가지로 구형에 가까운 형태이며(Fig. 1b) 세포 크기는 직선형보다 약간 작았다(10.1±3.9 μm×9.3±3.2μm).
- 이러한 특징들이 유전적인 차이로 반영된 것이라는결론을 내리기에는 현실적으로 증거가 부족하다. 다만 유전적 차이에 앞서 명확한 형태적 차이로 인해 이 두 strain을 Anabaena circinalis의 형태적 변이종(morphotype)으로 취급하는 것이 바람직하다고 사료된다.
- circinalis 종으로 확인되었다(98%~100%의 유전적 유사도). 또한 직선형과 나선형 strain 모두에서 geosmin을 합성하는 유전자 구간이 발견되어, 북한강 수계에 존재하는 Anabaena circinalis는 종의 형태적 변이에 관계없이 geosmin을 생산할 수 있음을 보여주었다. 본 연구의 결과는 유전자 수준에서 A.
- 북한강 수역에서 발생하는 두 종류의 A. circinalis strain들이 유전적으로 98%의 유사도를 보여 동일종으로 판정되었다 할지라도, 염기서열 1309쌍 중 28쌍의 차이(2%)는 Anabaena circinalis 종 내에서 직선형 사상체와 나선형 사상체 간에 유전적 분화(변이)의 진행 가능성을 시사한다. 특히, 두 strain 간 사상체의 직선형과 coil 형이라는 형태적으로 명확한 차이와 함께 세포 크기의 차이는 현미경 관찰로도 어렵지 않게 구분되는 특징이다.
- 2). 북한강에서 분리한 직선형과 나선형 Anabaena strain의 경우에도 현미경 관찰 시 형태학적으로 구분이 어려운 A. crassa와 A. circinalis의 특징을 보였으나 계통도를 통한 유전적 분류에서는 A. circinalis 단일 종으로 수렴되었다 (Fig. 2). 이와 같이 유전자를 이용한 분류방법은 환경변화에서 기인하는 형태적 변이가 현미경 동정 시 발생할수 있는 오류를 최소화하는 한편, 육안으로 구분하기 어려운 두 종을 명확하게 구별할 수 있다는 장점을 지닌다.
- 이와 같은 결과는 북한강에서 발생한 두 가지 형태의 Anabaena strain이 종 수준에서 동일함을 보여준다. 선행 연구들의 유전적 유사도 분석을 통한 종판별의 결과와 비교할 때, 본 연구에서 대상으로 하고 있는 두 strain 간의 98%의 유전적 유사도는 같은 종으로 판단하는 데 문제가 없다고 사료된다. Jagadeesan et al.
- 의 geosmin 형성 유전자와 각각 99%, 81%의 상동성을 보였다. 이 결과는 북한강 수계에 존재하는 Anabaena circinalis는 종의 형태적 변이에 관계없이 geosmin을 생성할 수 있음을 보여준다. 실제로 본 연구의 선행연구에서 Anabaena circinalis 영양세포가 geosmin을 생산함을 확인하였다(HRWEMD, 2012).
- , 2012). 이러한 모호함은 본 연구에서 형태적인 차이를 보임에도 불구하고 유전자 계통학적으로는 단일종으로 나타난 A. circinalis와 A. planktonica, A. solitaria의 경우에도 나타났다(Fig. 2). 북한강에서 분리한 직선형과 나선형 Anabaena strain의 경우에도 현미경 관찰 시 형태학적으로 구분이 어려운 A.
- circinalis의 geosmin 생산 잠재성을 유전자 수준에서 판단하기 위해 세포의 DNA에서 geosmin 형성 유전자 증폭을 수행하였다. 증폭된 산물을전기영동으로 분석한 결과, 두 가지 형태 모두에서 565 bp 크기의 유전자 염기서열이 100% 일치하는 band가 나타났다(Table 2). 해당 염기서열을 NCBI의 유전자 은행 database에서 BLAST 검색 한 결과, Anabaena ucrainica CHAB strian과 Oscillatoria sp.
- 직선형 사상체의 최장길이는 최소 124 μm 에서부터 최대 563 μm까지 다양하게 관찰되었으며, 단일세포는 원형에 가까운 타원 형태로 평균적으로 10.6±1.9 μm×11.2±2.9 μm (폭×길이)의 크기를 보였다.
후속연구
- 실제로 본 연구의 선행연구에서 Anabaena circinalis 영양세포가 geosmin을 생산함을 확인하였다(HRWEMD, 2012). Geosmin을 생산하는 A. circinalis는 대만(Tsao et al., 2014)과 중국(Su et al., 2013) 등 아시아 지역에서 보고된 바 있으나 국내에서는 본 연구의 결과가 최초의 보고로서 북한강 수계에서 geosmin 증가의 원인종 확인 및 관리에 중요한 자료를 제공한다고 사료된다. 그러나 현장에서 Anabaena circinalis에 의한 geosmin 발생과 변화를 보다 명확하게 이해하기 위해서는 다양한 환경조건에의 생리ㆍ생태적 연구가 필요하다.
- , 2013) 등 아시아 지역에서 보고된 바 있으나 국내에서는 본 연구의 결과가 최초의 보고로서 북한강 수계에서 geosmin 증가의 원인종 확인 및 관리에 중요한 자료를 제공한다고 사료된다. 그러나 현장에서 Anabaena circinalis에 의한 geosmin 발생과 변화를 보다 명확하게 이해하기 위해서는 다양한 환경조건에의 생리ㆍ생태적 연구가 필요하다.
- 또한, 환경변화에 따른 형태적 변이에 비해 유전자 수준의 변형은 상대적으로 오랜 시간에 걸쳐 발생하므로 특정 남조류의 16S rRNA 염기서열을 밝혀낸다면 다른 남조류의 염기서열과 계통학적인 유연관계를 분석하여 형태학적 변이에 영향을 받지 않고 종을 동정하는 것이 가능하다. 또한, 이미 밝혀진 남조류의 특정 대사부산물질 생산능력에 관여하는 유전자 구간을 이용한 탐침은 관심 있는 해당 종의 대사부산물질 생산능력의 유무를 파악할 수 있게 한다.
- , 2001) 형태학적인 분류가 어려운 박테리아 등과 같은 미생물의 동정에 널리 사용된다. 또한, 환경변화에 따른 형태적 변이에 비해 유전자 수준의 변형은 상대적으로 오랜 시간에 걸쳐 발생하므로 특정 남조류의 16S rRNA 염기서열을 밝혀낸다면 다른 남조류의 염기서열과 계통학적인 유연관계를 분석하여 형태학적 변이에 영향을 받지 않고 종을 동정하는 것이 가능하다. 또한, 이미 밝혀진 남조류의 특정 대사부산물질 생산능력에 관여하는 유전자 구간을 이용한 탐침은 관심 있는 해당 종의 대사부산물질 생산능력의 유무를 파악할 수 있게 한다.
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