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문제 정의
- Hamissou et al(2013)의 연구에서는 여주는 높은 SOD 활성을 보이는 식품이나, 본 연구에서는 뚜렷한 차이를 보이지 않았다. 본 실험에서는 SOD 수준에 유의성이 검증되지 않은 것으로 생각되며, SOD 활성이 없거나 부족한 경우에는 산소에 의해 매개되는 손상에 대해 어떤 다른 형태의 방어기작을 선택하리라고 추정된다.
- 본 연구에서는 당뇨 시 식사요법에서 식재료로 활용하기 위해 streptozotocin(STZ) 당뇨 유발 흰쥐에게 여주열매를 식이에 분말로 첨가하여 혈장의 지질대사물 수준과 간 조직의 시토졸에서 항산화효소 수준에 대한 자료를 제시하고자 하였다.
가설 설정
- 4) NS not significantly different among groups.
제안 방법
- 0 mL에 기질인 30% hydrogen peroxide(H2O2)를 2 µL를 넣어 25℃ 290 nm에서 5분간 흡광도를 측정하였다. H2O2의 흡광도 변화와 H2O2의 몰흡광계수로 H2O2의 농도를 구하여 효소수준을 계산하였다. Superoxide dismutase(SOD) 수준은 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색을 이용한 Maklund & Marklund(1974)의 방법을 사용하여 5분 동안 pyrogallol의 auto oxidation 억제 정도를 325 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 실험군은 정상 대조군(Control) 1개 군과 당뇨 실험군 3개 군으로 정상 대조군은 여주열매를 첨가하지 않고 당뇨를 유발하지 않았다. 당뇨 실험군은 모두 STZ으로 당뇨를 유발하였으며, 여주열매를 첨가하지 않은 당뇨 대조군(STZ-control)과 여주열매를 각각 5%(BM-5%)와 10%(BM-10%)를 식이에 첨가하여 당뇨 실험을 하였다. 정상 대조군과 당뇨 실험군은 AIN-93 조제식이(Reeves PG 1997)로 공급하였다.
- 01 M citrate buffer 용액을 동량으로 하여 당뇨 실험군과 같은 방법으로 주사하였다. 당뇨유발의 확인은 24시간 후 안구정맥총에서 채혈하여 원심분리한 후 상등액을 취하여 혈장 중의 포도당 농도가 300 mg/dL 이상인 동물을 당뇨가 유발된 것으로 확인하여 당뇨 실험에 사용하였다.
- 동물실험군은 1주일간 예비사육 후 체중에 따라 난괴법에 의해 4개 군으로 나누어 온도 22±3℃에서 스테인리스 스틸 케이지에 한 마리씩 넣고 실험에 사용하였다.
- Ltd, Setauket-East Setauket, NY, USA)시켜 시토졸 분획을 얻었다. 모든 실험조건은 4℃를 유지하면서 행하였고, 시토졸은 사용 전까지 -70℃에 보관하여 항산화효소 수준을 측정하였다.
- 실험 4주 후 공복 시키지 않고 마지막 날에 실험동물을 에테르로 마취시켜서 단두로 희생시킨 후, 채혈 후에는 헤파린으로 처리된 시험관에 혈액을 모아 3,000 rpm에서 15분간 원심분리(HA 300, Hanil Centrifuge Co. Ltd, Seoul, Korea)한 후 혈장을 취해 지방대사물의 수준을 측정하였다. 채혈 후에는 즉시 개복하여 간장을 적출하여 장기의 무게를 측정 후 -70℃에 냉동 보관하여 효소 수준을 측정하였다.
- 동물실험군은 1주일간 예비사육 후 체중에 따라 난괴법에 의해 4개 군으로 나누어 온도 22±3℃에서 스테인리스 스틸 케이지에 한 마리씩 넣고 실험에 사용하였다. 실험군은 정상 대조군(Control) 1개 군과 당뇨 실험군 3개 군으로 정상 대조군은 여주열매를 첨가하지 않고 당뇨를 유발하지 않았다. 당뇨 실험군은 모두 STZ으로 당뇨를 유발하였으며, 여주열매를 첨가하지 않은 당뇨 대조군(STZ-control)과 여주열매를 각각 5%(BM-5%)와 10%(BM-10%)를 식이에 첨가하여 당뇨 실험을 하였다.
- 95 g이 함유되어 있으므로 , 옥수수 전분, 분당, 섬유소, 카제인, 대두유 및 무기질의 실험 식이를 변형하였다. 실험군의 식이는 AIN-93 조제식이를 변형하여 실험동물에게 분말화한 실험재료인 여주열매(w/w)를 각각 5%와 10%씩 첨가정도를 달리하여 각각의 해당식이로 4주간 공급하였고, 실험 식이와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다(Table 1).
- 01 M citrate buffer에 45 mg/kg bw 농도로 녹여 꼬리정맥에 주사하였다. 정상 대조군은 0.01 M citrate buffer 용액을 동량으로 하여 당뇨 실험군과 같은 방법으로 주사하였다. 당뇨유발의 확인은 24시간 후 안구정맥총에서 채혈하여 원심분리한 후 상등액을 취하여 혈장 중의 포도당 농도가 300 mg/dL 이상인 동물을 당뇨가 유발된 것으로 확인하여 당뇨 실험에 사용하였다.
- Ltd, Seoul, Korea)한 후 혈장을 취해 지방대사물의 수준을 측정하였다. 채혈 후에는 즉시 개복하여 간장을 적출하여 장기의 무게를 측정 후 -70℃에 냉동 보관하여 효소 수준을 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 시료로 사용한 여주는 서울시 동대문구 제기 2동에 있는 용성건재(사업자등록번호: 204-92-77858)로부터 구입한 것으로, 우리나라 충청남도에서 야생 재배하여 2012년 10월에 수확한 것을 자연 건조시켜 씨를 뺀 뒤 분쇄(분쇄기 HMF-3450S, Seoul, Korea)하여 열매만 분말로 만들어 냉장 보관하여 실험 식이에 시료로 사용하였다.
-
2. 실험동물 사육 및 실험식이
실험동물은 체중 220 g 내외로 7주령인 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 샘타코(NTacSam: SD, Samtako BioKorea, Osansi, Korea)로부터 구입하여 환경에 적응시키기 위해 고형사료(Feedlap, Gurisi, Korea)로 1주일간 예비 사육하였다. 본 동물실험은 덕성여대 동물실험 윤리위원회의 승인(승인번호 2011-002)을 받은 후 실험동물 관리 및 이용에 관한 지침에 맞추어 실시하였다.
데이터처리
- 2) Values with different superscripts within the same column are significantly different at the p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- 3) Values with different superscripts within the same column are significantly different at the p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- 본 연구의 통계학적 분석은 SPSS program(Ver. 18, SPSS Inc. Chicago, IL, USA)을 이용하여 실시하였고, 분석수치는 평균과 표준편차(standard deviation: SD)로 표시하였다. 실험군 간의 차이는 one way ANOVA를 실행하여 검증하였고, p<0.
- 실험군 간의 차이는 one way ANOVA를 실행하여 검증하였고, p<0.05 수준에서 유의성이 관찰된 경우, 각 실험군 간의 평균값의 차이에 대한 유의성은 Duncan's multiple range test를 이용하여 p<0.05 수준에서 평가하였다.
이론/모형
- Catalase(CAT)의 수준은 Aebi H(1984)의 방법에 따라 67 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0) 1.0 mL에 기질인 30% hydrogen peroxide(H2O2)를 2 µL를 넣어 25℃ 290 nm에서 5분간 흡광도를 측정하였다.
- Superoxide dismutase(SOD) 수준은 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색을 이용한 Maklund & Marklund(1974)의 방법을 사용하여 5분 동안 pyrogallol의 auto oxidation 억제 정도를 325 nm에서 흡광도를 측정하였다. Glutathione-S-transferase(GST)의 수준은 Habig et al(1974)의 방법에 준해 0.1 M phosphate 완충액(pH 6.5) 일정량에 시토졸과 1-chloro-2,4-dinitrobenzene(CDNB) 및 glutathione을 혼합하여 25℃에서 반응시킨 다음, 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. Xanthine oxidase(XOD) 수준은 xanthine을 기질로 하여 생성된 uric acid를 측정하는 Bergmeyer et al(1974)의 방법으로 3.
- Korea)로 분석하였다. HDL-콜레스테롤(high density lipoprotein cholesterol: HDLchol)은 덱스트란 황산나트륨 효소(Finely et al 1978)법으로 kit (Bio Clinical System Co. Anyang City Gyeonggido. Korea)를 사용하여 측정하였다. 중성지방(triglyceride: TG)은 흡광도 550 nm에서 효소비색(Giegel et al 1975)법을 이용한 kit (EMBIEL Co.
- Superoxide dismutase(SOD) 수준은 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색을 이용한 Maklund & Marklund(1974)의 방법을 사용하여 5분 동안 pyrogallol의 auto oxidation 억제 정도를 325 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 5) 일정량에 시토졸과 1-chloro-2,4-dinitrobenzene(CDNB) 및 glutathione을 혼합하여 25℃에서 반응시킨 다음, 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. Xanthine oxidase(XOD) 수준은 xanthine을 기질로 하여 생성된 uric acid를 측정하는 Bergmeyer et al(1974)의 방법으로 3.0 mL의 혼합용액(33 mM potassium phosphate, 0.05 mM xanthine, 0.02 unit xanthine oxidase)을 cuvette에 넣은 후 시토졸을 첨가하여 25℃, 290 nm에서 흡광도 증가속도를 측정하였다.
- 간 조직 중에 함유되어 있는 지질과산화물(malondialdehyde: MDA)의 수준은 Mihara & Uchiyama(1978)의 방법을 이용하여 분석하였다.
- 간 조직 중에 함유되어 있는 지질과산화물(malondialdehyde: MDA)의 수준은 Mihara & Uchiyama(1978)의 방법을 이용하여 분석하였다. 간 조직에서 MDA 생성량을 계산하고, Lowry et al(1951)의 방법에 단백 수준을 정량한 후 이를 nmol/mg protein으로 나타내었다.
- 당뇨 실험군은 모두 STZ으로 당뇨를 유발하였으며, 여주열매를 첨가하지 않은 당뇨 대조군(STZ-control)과 여주열매를 각각 5%(BM-5%)와 10%(BM-10%)를 식이에 첨가하여 당뇨 실험을 하였다. 정상 대조군과 당뇨 실험군은 AIN-93 조제식이(Reeves PG 1997)로 공급하였다. USDA nutrient database(accessed on 06.
- Korea)를 사용하여 측정하였다. 중성지방(triglyceride: TG)은 흡광도 550 nm에서 효소비색(Giegel et al 1975)법을 이용한 kit (EMBIEL Co. Gunposi Gyeonggido. Korea)로 수준을 측정하였다.
- 혈장 중의 유리지방산(free fatty acid: FFA)은 SICDIA-NEFAZYME 효소법(Kanai & Kanai 1983)에 의해 NEFAZYMES kit(Shinyang Chemical Co. Ltd. Seoul. Korea)로 분석하였다.
성능/효과
- )을 줄이는 작용으로 CAT와 비슷한 작용으로 보인다(Wilcox CS 2010). CAT와 SOD는 간에서 공생적인 방어기능을 할 수 있는 효소로, 본 실험에서는 SOD 활성에서 뚜렷한 수준 차이를 보이지 않았고, CAT 수준에도 유의적인 차이가 없는 것으로 여주 첨가 시에는 과산화물의 분해가 CAT와 SOD의 수준에 의해서 영향을 미치지 못한 것으로 추정된다.
- HDL-콜레스테롤 수준은 정상 대조군(21.3±2.8 mg/dL)과 당뇨 대조군(23.7±5.5 mg/dL)에서는 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 당뇨 대조군에 비해 BM-5%군(33.3±5.4 mg/dL)에서는 유의적으로 높은 수준으로 정상 대조군보다 높은 수준이었다.
- 간 조직의 SOD 수준은 정상 대조군(1.15±0.16 unit/min/mg protein)과 당뇨 대조군(1.14±0.12 unit/min/mg protein) 사이에 유의적인 차이를 보이지 않았고, 여주 첨가 시 당뇨 실험군 간에도 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 간 조직의 XOD의 수준을 측정한 결과, 정상 대조군(225.3±65.7 unit/min/mg protein)과 당뇨 대조군(234.2±43.5 unit/min/mg protein)에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 간 조직의 단백질은 정상 대조군(173.8±9.5 mg/g)과 당뇨 대조군(217.5±14.4 mg/g)에서 유의적인 수준 차이를 보였고, 모든 실험군 중 BM-10%군(240.0±13.5 mg/g)에서 간 조직의 단백질 수준이 유의적으로 높게 나타났다 (Table 3).
- 간 조직의 시토졸에서 CAT 수준은 정상 대조군(18.5±4.1 unit/min/mg protein)과 당뇨 대조군(22.4±5.0 unit/min/mg protein)에서는 유의적이었으나, 당뇨 실험군에서는 유의적 차이는 아니었다(Table 4).
- 간 조직의 시토졸에서 GST 수준을 측정한 결과, 정상 대조군(318.2±24.6 unit/min/mg protein)보다 당뇨 대조군(266.2±16.7 unit/min/mg protein)의 수준이 유의적으로 낮았다.
- 본 실험에서는 여주로 처리시 GST 수준이 높아졌는데, 여주의 추출물 실험(Tripathi & Chandra 2009)에서도 GST 수준이 당뇨 시 보다 높아졌다.
- 산화적인 스트레스로 생성된 ROS 등의 유리기 제거에 여주는 scavenger의 작용을 보여준다(Moore et al 2013). 본 연구 결과, SOD 수준에는 변화를 보이지 않았으나, XOD 수준은 낮아지는 경향을 보였고, BM-5%군에서는 뚜렷하게 낮아져 여주 첨가량에 따른 양적인 차이를 나타내었다.
- 본 연구 결과에서도 당뇨 시 중성지방 및 유리지방산은 정상 시보다 수준이 증가하는 차이를 보였으나, HDL-콜레스테롤 수준은 당뇨 시 감소한다는 것과 다르게 차이가 없었다.
- 여주 분말의 첨가에 따른 간장의 MDA 수준은 정상 대조군(0.80±0.08 nmol/mg protein)과 당뇨 대조군 사이에는 유의 적인 수준 차이를 보이지 않았으나, 모든 실험군 중 BM-10%군(0.95±0.08 nmol/mg protein)에서 MDA 수준이 유의적으로 높은 수준이었다.
- 유리지방산 수준은 정상 대조군(578.2±23.5 μEq/L)에 비해 당뇨 대조군(786.3±59.9 μEq/L)에서 유의적으로 높은 수준이었으나, 당뇨 대조군에 비해 당뇨 실험군에서는 유의적인 차이는 보이지 않았다.
- 중성지방 수준은 정상 대조군(68.5±10.1 mg/dL)에 비해 당뇨 대조군(166.0±51.5 mg/dL)에서 높게 유의적인 차이를 보였으나, 당뇨 대조군에 비해 당뇨 실험군에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다.
후속연구
- 당뇨 시 이상지질혈증은 혈관 내피조직에 손상을 주어 LPL 활성이 감소되어 중성지방수준 증가, HDL-콜레스테롤 수준 감소가 일어나며, 당뇨 시 중성지방 수준보다 HDL-콜레스테롤 수준이 심혈관계 등의 합병증 위험도를 높이는데 더 크게 영향을 주므로(Hirano T 2014, Silva et al 2014, Vijayaraghavan K 2010), 여주분말 섭취에 따른 HDL-콜레스테롤 수준 변화에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.
- 본 연구에서는 당뇨 시 간 조직의 단백질 수준이 높아진 결과로 간 단백질의 이용 전단계인지, 인슐린에 크게 영향을 받지 않는 것인지 그 기전에 대한 연구가 필요하다고 생각된다.
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