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문제 정의
- 본 연구는 항암 활성이 우수한 때죽나무 수피 추출물로부터[5] 활성물질을 분리 ․ 정제하였으며, 여기서 얻어진 화합물에 대해서는 MS, NMR 등의 기기 분석을 이용하여 그 화학구조를 명확히 동정하였다. 따라서 때죽나무 수피 추출물과 단리물질 항암 활성 실험을 통하여 기능성 식품 소재로서의 개발 및 이용가치를 평가하고자 하였다.
- 이 실험은 계획된 세포의 사멸 즉 apoptosis를 억제함으로써 세포 생존기간을 연장시켜 종양 발생에 관여하는 Bcl-2 단백질의 발현량을 측정하여 암의 발생에 대해 측정하는 방법이다. 1.
제안 방법
- 1.0 × 106 cells/㎖ 정도의 유방암 세포인 MCF-7을 사용하여 cytochrome c의 Western blotting을 위한 세포질성 단백질을 분리하였다.
- 1.0 × 106 cells/㎖ 정도의 정상 신장세포인 HEK293을 사용하여 cytochrome c의 Western blotting을 위한 세포질성 단백질을 분리하였다.
- 전기영동이 끝난 gel을 분리하여 Western blotting 장치에 설치한 후 여기에 transfer buffer를 채우고, 50V로 2시간 전이하고 membrane을 분리하여 30분간 blocking solution으로 blocking한 후 BclXL 혹은 Mcl-1에 대한 1차 항체를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. Membrane을 blocking solution으로 잘 soaking 한 후 여기에 horseradish peroxidase 또는 alkaline phosphataserk 중합되어 있는 anti-mouse immunoglobulin G 항체 또는 anti-mouse immunogolbulin G 항체를 첨가하여 30분간 반응시켰다. 위에서와 같이 PBS, PBST를 바꾸어 가면서 membrane을 세척한 다음 membrane에 ECL 발색 시약을 첨가하여 반응시킨 후 X-선 필름에 적정 시간 동안 노출시켰다[8].
- 전기영동이 끝난 gel을 분리하여 Western blotting 장치에 설치한 후 여기에 transter buffer를 채우고, 50V로 2시간 전이하고 membrane을 분리하여 30분간 blocking solution으로 blocking한 후 BclXL 혹은 Mcl-1에 대한 1차 항체를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. Membrane을 blocking solution으로 잘 soaking 한 후 여기에 horseradish peroxidase 또는 alkaline phosphataserk 중합되어 있는 anti-mouse immunoglobulin G 항체 또는 anti-rabbit immunogolbulin G 항체를 첨가하여 30분간 반응시켰다. 위에서와 같이 PBS, PBST를 바꾸어 가면서 membrane을 세척한 다음 membrane에 ECL 발색 시약을 첨가하여 반응시킨 후 X-선 필름에 적정 시간 동안 노출시켰다[13].
- SRB assay를 이용하여 정상 신장세포(HEK293)에 대한 각 sample 농도에서 세포독성을 측정하고, SRB assay를 이용하여 각 암세포주의 생육억제 활성을 측정한 후 각 농도에서의 세포독성에 대한 암세포 생육 억제 활성의 비로 selectivity를 계산한다[7].
- 다시 SJ-2 분획물(225.23 g)을 silica gel column (8.0 × 36.0 cm, benzene-MeOH = 5 : 1, v/v)으로 250 ㎖씩 분취하여 65개의 분취물을 얻었으며, 이들 분취물을 6개의 분획물(SJ-2-1~SJ-2-6)로 나누었다.
- 세포 관찰 후 다시 well을 건조한 후 50 ㎕의 Converter POD를 첨가하고 이것 또한 누출 방지를 위해 파라필름으로 감싸 incubator에서 30분가량 방치한 후 PBS로 3회 세척을 한다. 다시 여기에 100 ㎕의 DAB-substrate solution을 첨가하여 상온에서 10분간 방치 후 PBS로 3회 세척한 후에 최종적으로 광학현미경으로 세포의 사멸형태를 관찰한다[14-15].
- 추출수율을 측정하기 위한 HPLC 기기는 BIOTEK instrument (Italy)사의 HPLC 500 series로 Pump : BIO-TEK 522 controller, Column : Alltech Prevail C18 5 μ, Detector : BIO-TEK HPLC 535 Detector 를 사용하였다. 단리한 화합물의 질량(MS) 스펙트럼 은 JEOL JMS-SX102A, 그리고 1H-, 13C-NMR, HMQC (1H Detected Multiple Quantum Coherence), HMBC (1H Detected Multiple Bond Connectivity) 등의 핵자기공명(Nuclear magnetic resonance : NMR) 스펙트럼은 Varian Unity-Inova 500 MHz을 사용하여 측정하였다.
- 따라서, 인간 정상 신장세포인 HEK293을 이용하여 각 시료에 대한 Bcl-2의 발현에 미치는 영향을 검토하였으며 Bcl-2의 발현량을 나타나게 하기 위해 Densitometer를 이용하여 IOD 값을 측정하여 발현량을 비교하였다. 때죽나무 추출물의 Bcl-2 발현량을 살펴본 결과는 Fig.
- 때죽나무 수피를 음건시킨 후, 분쇄기로 분말화 하였으며, 그 분말시료를 메탄올(Methanol, MeOH) 에 72시간 동안 실온에서 침지시켜 조추출물을 얻었으며, 이 조작을 3회 실시하였다. 여기서 얻어진 수피 메탄올 조추출물은 노르말 헥산(n-hexane), 디클 로로메탄(Dichrolomethane, CH2Cl2), 에칠아세테이트 (Ethyl acetate, EtOAc) 등의 용매를 사용하여 순차연 속추출하여 분획하였다.
- 때죽나무 수피의 CH2Cl2 가용부(230.0 g)를 Sephadex LH-20을 충진제로 한 컬럼크로마트 그라 피(8.5 × 43.5 cm, MeOH-EtOH = 1 : 1, v/v)를 이용 하여 100 ㎖씩 52개, 그리고 250 ㎖씩 6개의 분취물을 얻어, 이 분취물들을 박층 chromatography (TLC, 전개용매: toluene-ethyl formate-formic acid = 5 : 4 : 1, v/v/v)에 전개시킨 후, UV lamp (254 nm)로 검색하여 4개의 분획물(SJ-1~SJ-4)로 나누었다.
- 때죽나무(Styrax japonica) 수피를 메탄올로 추출하였고, 수피 추출물은 n-hexane, CH2Cl2, EtOAc의 순으로 분획물을 얻었으며, 이 중 CH2Cl2 가용부에 대해 silica gel column chromatography를 수행하고 1H-NMR, 13C-NMR, FAB-MS, DEPT, COSY, HMQC, HMBC 스펙트럼 등이 기기분석을 통하여 styraxlignolide F를 단리할 수 있었다.
- 0 ㎎/㎖로 100 ㎕씩 첨가하여 48 시간 배양하였다. 배양이 완료된 후에 상등액을 제거하고 차가운 10% (w/v) TCA (Trichloroactic acid) 100 ㎕를 가하여 4℃에서 1시간 동안 방치한 후 증류수로 4~5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온에서 plate를 건조한 뒤 각 well에 1% (v/v) acetic acid에 녹인 0.4% (w/v) SRB용액을 100 ㎕씩 첨가하고 상 온에서 30분 동안 염색시켰다. 결합되지 않은 SRB 염색액은 1% acetic acid로 4~5회 정도 세척, 건조시킨 후에 10 mM Tris buffer 100 ㎕를 첨가하여 염색 액을 녹여낸 후 540 nm에서 ELISA reader를 이용해 흡광도를 측정하였다.
- 본 연구는 항암 활성이 우수한 때죽나무 수피 추출물로부터[5] 활성물질을 분리 ․ 정제하였으며, 여기서 얻어진 화합물에 대해서는 MS, NMR 등의 기기 분석을 이용하여 그 화학구조를 명확히 동정하였다. 따라서 때죽나무 수피 추출물과 단리물질 항암 활성 실험을 통하여 기능성 식품 소재로서의 개발 및 이용가치를 평가하고자 하였다.
- 6 mm)이 며, 10 ㎕의 sample을 주입하였다. 분리 용매는 acetonitrile을 이용하여 10%에서 70%까지 gradient method를 이용하여 분리하였으며 유속은 1 ㎖/min 으로 하였다.
- 추출수율은 단리화합물을 내부표준액으로 하여 3 point calibration하여 각 point당 3회 반복하여 평균을 구하고 그에 대한 적분 값을 기준을 삼았다. 분석을 위한 시료제조는 디클로로메탄 층의 추출물을 완전 농축하여 얻어진 분말을 1 ㎎/㎖이 되도록 메탄 올에 녹인 후 0.45 ㎛ syringe filter로 여과한 후 LC 시료로 사용하였다. HPLC는 Waters 600 pump와 controller를 이용하였으며 Waters 486 UV system을 이용하여 254 nm에서 확인 정량하였다.
- 때죽나무 수피를 음건시킨 후, 분쇄기로 분말화 하였으며, 그 분말시료를 메탄올(Methanol, MeOH) 에 72시간 동안 실온에서 침지시켜 조추출물을 얻었으며, 이 조작을 3회 실시하였다. 여기서 얻어진 수피 메탄올 조추출물은 노르말 헥산(n-hexane), 디클 로로메탄(Dichrolomethane, CH2Cl2), 에칠아세테이트 (Ethyl acetate, EtOAc) 등의 용매를 사용하여 순차연 속추출하여 분획하였다.
- 이 중 각 분획물을 TLC 확인하여 하나의 spot으로 나타나는 SJ-2-4 분획물 (63.26 g)을 silica gel column (5.0 × 30.0 cm, CH2Cl2-MeOH = 8 : 1, v/v)으로 100 ㎖씩 분취하여 4개의 분취물을 얻었으며, 이 중 SJ-2-4-2 로부터 화합물(780.0 mg)을 단리하였다(Fig. 1).
- 이로써 단리화합물은 phenylpropane 류 2분자가 축합한 lignan 구조로 C-9의 carboxyl기 가 결합하고 C-4에 D-glucose가 β 결합한 8'-[(3',4'- dimethoxyphenyl)methyl]-8-[(4-O-β-D-glucopyranosyl)-3-methoxyphenyl)oxolan-9'-one인 styraxlignolide F로 동정하였다(Fig. 1).
- 인간 폐암세포인 A549 (lung carcinoma, human)을 이용해 세포의 자가사멸형태를 관찰하기 위하여 A549를 배양한 후 이 배양된 인간 폐암세포인 A549 세포를 6 well plate에 3.0 × 104 cell/㎖로 각 well에 4 ㎖씩 분주한 후 각 well의 A549 세포를 5일간 세포 사멸형태를 TUNEL 염색법을 이용하여 관찰하였다.
- 0 × 106 cells/㎖ 정도의 정상 신장세포인 HEK293을 사용하여 cytochrome c의 Western blotting을 위한 세포질성 단백질을 분리하였다. 일단 플라스크에 있는 배지를 제거하고 cold PBS를 첨가한 후 scraper로 세포를 수집하였다. 10초간 원침하여 상등액을 버린 후 400 ㎕의 cold buffer A (10 mM Hepes-KOH[pH7.
- 추출수율은 단리화합물을 내부표준액으로 하여 3 point calibration하여 각 point당 3회 반복하여 평균을 구하고 그에 대한 적분 값을 기준을 삼았다. 분석을 위한 시료제조는 디클로로메탄 층의 추출물을 완전 농축하여 얻어진 분말을 1 ㎎/㎖이 되도록 메탄 올에 녹인 후 0.
- 다 건조된 well에 50 ㎕의 TUNEL 혼합용액을 첨가하는데, 이때 용액의 누출 방지를 위해 well 주위를 파라필름을 이용하여 잘 감싼다. 파라필름으로 감싼 well plate를 incubator에서 60분간 방치 후 PBS로 3회 세척한 후 형광현미경으로 세포를 관찰한다. 세포 관찰 후 다시 well을 건조한 후 50 ㎕의 Converter POD를 첨가하고 이것 또한 누출 방지를 위해 파라필름으로 감싸 incubator에서 30분가량 방치한 후 PBS로 3회 세척을 한다.
대상 데이터
- 3 ppm에서 C-6"의 carbon이 3급 탄소임을 확인할 수 있다. 3.71 ppm, 3.72 ppm, 3.74 ppm에서 -OCH3에 기인하는 methoxyl carbon 3개를 확인하였다. DEPT (45°, 90°, 135°)법 에 의한 스펙트럼에서는 135°에서 2.
- 때죽나무 수피의 전건조시료 227.31 g으로부터 메탄올 추출하여 44.74 g의 메탄올 추출물을 획득하였다. 이를 핵산(n-hexane), 디클로로메탄(CH2Cl2), 에칠아세테이트(EtOAc)를 이용하여 용매분획하여 얻은 수율은 각각 0.
- 본 실험에 사용된 공시수종은 2009년 9월 경남 하동군 화계면 정금리에 있는 35년생 때죽나무를 채취하여 사용하였다.
- 34%를 나타내었다. 분획물 중 유일하게 27.10% 함유하고 있는, 디클로 로메탄 층으로부터 활성성분인 styraxlignolide F을 단리하여 HPLC 정량분석을 위한 내부 표준물질로 사용하였다.
- 사용된 세포주로는 인간 폐암세포(A549)가 사용 되었다. Fig.
- 추출수율을 측정하기 위한 HPLC 기기는 BIOTEK instrument (Italy)사의 HPLC 500 series로 Pump : BIO-TEK 522 controller, Column : Alltech Prevail C18 5 μ, Detector : BIO-TEK HPLC 535 Detector 를 사용하였다.
이론/모형
- 때죽나무 수피 추출물(SJ-MeOH)의 CH2Cl2 가용 부로부터 한 개의 화합물을 단리하였고, 분리는 active guided fraction법을 이용하였다.
성능/효과
- 0 ppm사이에 D-glucose 에 기인하는 proton을 확인하였다. 13C-NMR spectrum에서는 100~160 ppm에서 밴젠에 기인하는 signal을 확인하였으며 기본구조인 carbon signal과 10~70 ppm 사이에 side chain에 해당하는 5개의 carbon signal을 확인하였으며 176.7 ppm에서 carbonyl carbon에 기인하는 signal을 확인할 수 있다. 60 ppm에서 80 ppm에서 D-glucose에 기인하는 carbon 5개를 확인하였으며 57.
- 60 ppm에서 80 ppm에서 D-glucose에 기인하는 carbon 5개를 확인하였으며 57.3 ppm에서 C-6"의 carbon이 3급 탄소임을 확인할 수 있다.
- 사용된 세포주로는 인간 폐암세포(A549)가 사용 되었다. Fig. 7은 시료 투여 3일부터 사멸이 시작되는 것을 확인할 수 있었으며, 이것은 추출물의 생육 저해에 의한 것으로 보이며 necrosis에 의한 사멸도 확인할 수 있었지만 대부분의 세포 사멸 형태는 apoptosis를 취하고 있음을 확인할 수 있었다. 이것으로 시료의 세포에 대한 영향이 3일째부터 작용하는 것으로 보인다.
- 5%로 가장 높은 항암 효과를 나타내었다. 그 다음으로 CH2Cl2 분획층에서 분리한 단리물질인 Styraxlignolide F가 높은 활성을 나타내었으며, 다른 분획층에 비해 낮은 세포독성으로 인해 모든 농도에서 3 이상의 가장 높 은 선택적 사멸도를 나타내었다.
- 4%로 가장 높은 항암 효과를 나타내었다. 그러나 선택적 사멸도는 Styraxlignolide F 가 모든 농도에서 3 이상으로 가장 높았고, CH2Cl2 분획층과 에틸아세테이트 분획층이 2~3 사이였고, 헥산 분획층은 2 이하로 가장 낮은 선택적 사멸도를 나타내었다.
- 이것으로 시료의 세포에 대한 영향이 3일째부터 작용하는 것으로 보인다. 디클로로메탄 분획층에서 46.9%로 가장 높은 생육억제를 나타냈으며, styraxlignolide와 에틸아세테이트 분획층은 40% 정도의 세포사멸 비율을 나타내었다. 이것은 시료가 A549의 생육을 억제하였으며 apoptosis 및 necrosis를 일으켜 항암 작용이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
- 내부 표준물질을 3 point calibration하여 디클로로 메탄 가용부의 단리 화합물 함량을 계산한 결과 459 ㎍/g이었다. 디클로로메탄층의 함유 수율은 27.1%이며 메탄올 조추출물 기준으로는 5.00%, 건조시료 중 량 대비 수율은 1.31%로 나타났다.
- 74 ppm가 CH3 임 을 확인할 수 있다. 따라서 primary carbon이 7개, secondary carbon이 13개, tertiary carbon이 4개, quaternary carbon이 3개로 총 carbon의 수는 27개임을 확인하였다. HMBC spectrum에서 carboxyl기가 붙어 있는 C-9'는 이 spectrum을 통하여 H-9, H-8' H-7'와 의 교차피크로 확인하였으며 D-glucose의 anomer proton인 H-1"는 C-4에 연결된 glycoside임을 확인할 수 있다.
- 따라서 암세포의 생육억제는 CH2Cl2 분획층이 가 장 높았지만, 선택적 사멸도를 따져보았을 때 단리물 질인 styraxlignolide F가 더 높아 항암 소재로서의 가치는 단리물질이 높은 것으로 생각된다.
- 5에서 나타내었다. 때죽나무 추출물의 IOD 값을 비교한 결과 디클로로메탄에서 IOD 값이 가장 낮게 나타났으며, styraxlignolide F, 에틸아세테이트, 헥산의 순으로 나타났다. 이것은 정상 세포에서의 Bcl-2의 이상 혹은 과잉 발현을 막아 apoptosis를 유도함으로서, 비정상 세포로의 변이를 막음으로서 암 발생을 억제할 수 있을 것으로 생각된다.
- 때죽나무의 각 부위별 추출물의 항암 활성에 대한 비교실험에서 수피 추출물에서 여러 암세포에 대한 강한 생장 저해활성이 높게 나타난 결과를 통해[5] 항암 활성이 높은 수피 추출물에 대해 분획한 분획물과 단리물질인 styraxlignolide F와의 항암 활성 실험에서는 분획물들 중 CH2Cl2 가용부가 높은 항암 활성을 나타내었는데, 이는 단리물질인 styraxlignolide F의 함량차이 및 기타 성분들의 차이로 나타난 것으로 생각되고, 그 다음으로 styraxlignolide F가 높은 활성을 나타내었다. 하지만 세포독성에서는 오히려 styraxlignolide F가 CH2Cl2 가용부보다 낮은 독성을 나타내었다.
- 또한 고자장 측의 3.71 ppm 부근의 3개의 single signal은 methoxyl group (-OCH3) proton으로 확인할 수 있으며 4.87 ppm에서 1개의 glucose의 anomer proton에 해 당하는 피크를 확인할 수 있으며 결합정수가 J = 7.1 Hz이므로 당의 결합은 β form에 해당하는 것으로 확인하였다.
- 분획물과 단리물질에 대한 정상세포에 대한 세포독성과 각 암세포에 대한 성장 효과를 검토한 결과, Fig. 2은 인간 정상 신장세포 HEK293에 대한 세포독성을 나타낸 것으로 sample의 최고 농도인 1.0 ㎎/㎖에서 n-hexane에서 23.5%로 가장 높은 세포독성을 나타내 었고, 단리물질인 styraxlignolide F가 가장 낮은 세포 독성인 15.2%의 낮은 세포독성을 나타내었다.
- 2 정도로 차이가 나면 trans-형태라고 보고하였다. 실험에서 단리된 화합물의 경우, 3.9 ppm과 4.12 ppm에서의 proton을 H-9번 위치의 menthylene group proton으로 귀속하였으며, trans 형태의 특징적인 chemical shift 임을 확인하였다. 이로써 단리화합물은 phenylpropane 류 2분자가 축합한 lignan 구조로 C-9의 carboxyl기 가 결합하고 C-4에 D-glucose가 β 결합한 8'-[(3',4'- dimethoxyphenyl)methyl]-8-[(4-O-β-D-glucopyranosyl)-3-methoxyphenyl)oxolan-9'-one인 styraxlignolide F로 동정하였다(Fig.
- 3은 인간간암세포인 AGS에 대한 생육억제 활성 및 선택적 사멸도를 나타낸 것이다. 억제활성의 경우 대부분의 시료에서 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났으며, CH2Cl2 분획층이 50.5%로 가장 높은 항암 효과를 나타내었다. 그 다음으로 CH2Cl2 분획층에서 분리한 단리물질인 Styraxlignolide F가 높은 활성을 나타내었으며, 다른 분획층에 비해 낮은 세포독성으로 인해 모든 농도에서 3 이상의 가장 높 은 선택적 사멸도를 나타내었다.
- 하지만 세포독성에서는 오히려 styraxlignolide F가 CH2Cl2 가용부보다 낮은 독성을 나타내었다. 이를 바탕으로 CH2Cl2 가용부가 단리물질인 styraxlignolide F보다 높은 활성을 나타낸 이유는 CH2Cl2 가용부가 세포독성이 styraxlignolide F보다 높은 것과, 여러 가지 물질의 시너지 효과를 통해 활성이 상승작용을 한 것으로 사료된다.
- 74 g의 메탄올 추출물을 획득하였다. 이를 핵산(n-hexane), 디클로로메탄(CH2Cl2), 에칠아세테이트(EtOAc)를 이용하여 용매분획하여 얻은 수율은 각각 0.77%, 3.62%, 6.34%를 나타내었다. 분획물 중 유일하게 27.
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