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문제 정의
- 국내외에서 재배되고 있는 딸기 100품종의 DNA profile 데이터베이스를 구축하기 위하여 다형성이 높은 microsatellite 마커의 선정과 유전적 유사도 분석을 통한 품종식별력 검정 등에 대한 연구를 수행하였다. 딸기 21품종을 274개의 microsatellite 마커로 검정하여 반복 재현성이 높은 25개의 다형성이 높은 마커를 선정하였다.
- 따라서 본 연구에서는 microsatellite 마커를 활용하여 딸기 100 품종에 대한 품종식별용 마커의 선정 및 이를 활용한 DNA profile 데이터베이스 구축에 대한 일련의 연구를 수행 하여 얻어진 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- Microsatellite 마커의 다형성 정도를 조사하기 위하여 아래의 공식을 이용하여 polymorphism information content(PIC) 값을 산출하였다. 아래 식에서 n은 마커당 분석되어지는 대립유전자의 수, Pij는 마커 i의 밴드들 중에서 j번째 공통 밴드 패턴의 빈도수이다(Anderson et al.
- Microsatellite 분석을 통하여 재현성이 높고 다형성을 보이는 대립유전자를 마커로 선발하여 대립유전자의 유무 (dominant marker scoring; present = 1, absent = 0)에 따라 NTSYSpc(version 2.10b)(Rohlf, 2000) 컴퓨터 프로그램에 입력하고 Jaccard 방법에 준하여 유전적 유사도 값을 계산한 다음 unweighted pair-group method with arithmetical average (UPGMA) (Sneath and Sokal, 1973) 방법으로 집괴 분석하고 계통도를 작성하여 microsatellite 마커의 품종 식별력을 비교 분석하였다.
- PCR 반응은 딸기 게놈 DNA 30ng, 0.1μM의 SSR primer, 2.0μL dNTP mixture(2.5mM), Taq polymerase 1.0U, 2.5μL의 10 × PCR buffer(50mM KCl, 20mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.0mM MgCl2)에 증류수를 첨가하여 전체 부피를 25μL로 조절하였다.
- org)에서 제시된 microsatellite 프라이머의 염색체상 위치와 반복 염기서열 정도 등을 고려 하여 최종 274개를 선정하고 이들 프라이머와 21품종의 다형성 정도를 조사하였다. PCR 반응을 통한 증폭 산물은 6% 아크릴아마이드 젤에 2시간 전기영동한 다음 silver sequence TM staining reagents(Promega, USA)로 염색하여 polymorphism 여부를 확인하였다. 그리고 microsatellite primer 선발과정에서 다형성을 보이면서 대립유전자의 수가 많은 45개를 1차 선발하여 프라이머의 정방향에 FAM, VIC, NED, PET (Applied Biosystems, USA)으로 형광 표지한 다음 딸기 100품종(Table 1)에 대한 DNA profile 데이터베이스 구축에 이용하였다.
- PCR(C1000, BioRad, USA) 증폭은 94°C에서 30초간 denature 한 후, 55°C에서 30초 annealing, 72°C에서 45초간 extension을 40cycle 수행하였다.
- PCR이 완료된 후 3.0μL의 증폭산물을 2.5% 아가로스 젤에서 전기 영동하여 증폭 여부를 확인한 다음, 초순수 150μL에 PCR 산물 1.5μL를 희석하였다.
- 공시 품종의 엽조직을 액체질소를 이용하여 마쇄한 다음 NucleoSpin® PlantII(Macherey-Nagel Cat. 740 770.250, Germany) 키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다.
- PCR 반응을 통한 증폭 산물은 6% 아크릴아마이드 젤에 2시간 전기영동한 다음 silver sequence TM staining reagents(Promega, USA)로 염색하여 polymorphism 여부를 확인하였다. 그리고 microsatellite primer 선발과정에서 다형성을 보이면서 대립유전자의 수가 많은 45개를 1차 선발하여 프라이머의 정방향에 FAM, VIC, NED, PET (Applied Biosystems, USA)으로 형광 표지한 다음 딸기 100품종(Table 1)에 대한 DNA profile 데이터베이스 구축에 이용하였다.
- 딸기 품종식별에 효과적인 microsatellite 마커를 선발하기 위하여, ‘Kurume 52’, ‘Seolhyang(설향)’, ‘Maehyang(매향)’, ‘Akihime’, ‘Redpearl’, ‘Jumbo’, ‘Chodong’, ‘Donner’, ‘Sukyoung(수경)’, ‘Santa(싼타)’, ‘Daeun(대운)’, ‘Albion’, ‘Black Monte’, ‘Flether’, ‘Eyehime’, ‘Solar’, ‘Ca51 Sr-1’, ‘Jaspan’, ‘Lihn’, ‘Marshall’, ‘Everberry’ 품종과 국제장미과 게놈프로젝트(http://www.rosaceae.org)에서 제시된 microsatellite 프라이머의 염색체상 위치와 반복 염기서열 정도 등을 고려 하여 최종 274개를 선정하고 이들 프라이머와 21품종의 다형성 정도를 조사하였다.
- 25μL를 혼합한 다음 94°C에서 2분간 변성시켰다. 변성시킨 PCR 증폭 산물은 자동염기서열분석기(Genetic Analyzer 3130XL, Applied Biosystems, USA)를 활용하여 전기 영동한 다음 GeneMapper(version 3.7) 컴퓨터 프로그램(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 마커별 대립 유전자의 크기를 결정하였다.
- 추출된 DNA는 1.5% 아가로스젤에서 전기 영동하여 DNA 농도를 확인한 후 μL당 10ng의 농도로 정량하여 PCR 분석에 이용하였다.
대상 데이터
- 국내외에서 재배되고 있는 딸기 100품종의 DNA profile 데이터베이스를 구축하기 위하여 다형성이 높은 microsatellite 마커의 선정과 유전적 유사도 분석을 통한 품종식별력 검정 등에 대한 연구를 수행하였다. 딸기 21품종을 274개의 microsatellite 마커로 검정하여 반복 재현성이 높은 25개의 다형성이 높은 마커를 선정하였다. 이들 마커와 국내외에서 재배되고 있는 딸기 100품종을 검정하였을 때 마커당 평균 대립유전자수는 7.
- 본 연구에서는 국립종자원 서부지원과 농촌진흥청 국립원예특작과학원 및 경상북도농업기술원 성주과채류시험장에서 수집하여 보존되고 있는 딸기 100 품종을 공시하여 microsatellite 마커를 이용한 품종별 데이터베이스 구축에 활용하였다(Table 1). 공시 품종의 엽조직을 액체질소를 이용하여 마쇄한 다음 NucleoSpin® PlantII(Macherey-Nagel Cat.
이론/모형
- 2. A dendrogram depicting the classification of 100 strawberry cultivars constructed using unweighted pair-group method with arithmetical average (UPGMA) based on microsatellite markers. The numbers (1 to 100) at right side refer to the list of cultivars in Table 1.
성능/효과
- 25개의 microsatellite 마커를 이용하여 검출된 대립유전자의 크기를 근거로 딸기 100품종에 대한 유전적 다양성을 조사한 바(Fig. 2), 공시품종의 전체 유사도 지수는 0.27-1.00의 범위에 속하였고, microsatellite 마커의 유전자형에 의해 7개의 대그룹으로 구분됨을 확인할 수 있었다. I 그룹은 우리나라에서 육성된 ‘Seolhyang(설향)’ 등 20품종, 일본에서 육성된 ‘Akihime’ 등 20품종, 중국에서 재배되고 있는 1품종을 포함하여 42품종이 분포하였다.
- I-1 소그 룹에 속하는 23품종 중에서 우리나라에서 육성된 품종은‘Nonsan 1(논산1)’, ‘Suhong(수홍)’, ‘Manhyang(만향)’, ‘Chodong (초동)’ 4개의 품종뿐이었고 나머지는 일본에서 육성된 ‘Beni hoppe’ 등 17품종과 중국에서 수집된 유전자원인 ‘Chuncho’, 미국 유전자원 중 교배모본으로 널리 활용되고 있는 ‘Donner’ 품종이 속하였다.
- II 그룹은 ‘Daehak 1(대학1)’, ‘Eyeberry Busan(아이베리 부산)’, ‘Josaenghongsim(조생홍심)’, ‘Benizuru’, ‘Kurume103’ 5품종이 그룹화되었으며 1940년대 우리나라에서 선발 육종된 ‘Daehak 1(대학1)’은 ‘Josaenghongsim(조생홍심)’ 품종의 유전적 유사도가 90% 이상 높은 것으로 분석되었고 주로‘Benizuru’가 교배모본으로 활용된 품종들이 분포하였다.
- III 그룹은 유전적 유사도 0.46에서 3개의 소그룹으로 구분할 수있었으며, III-1은 우리나라에서 조직배양 기법으로 육성된‘Shinyeobong(신여봉)’ 품종과 미국에서 육성된 ‘Summerberry’ 품종이 속하였다.
- IV 그룹은 유사도 지수 0.47에서 2개의 소그룹으로 나누어졌는데 IV-1은 미국에서 재배되고 있는 ‘Columbia’ 등 8 품종, 일본에서 육성된 ‘Okitsu’ 등 2품종과 캐나다에서 개발된 ‘Blomidon’과 ‘Cornwallis’ 2품종이 속하였다.
- IV-2 그룹은 ‘Blakemore’ 등 5품종이 그룹화되었고 ‘Tohoku 13’과 ‘Vasper’ 품종이 95% 이상의 높은 유전적 유사도를 나타내 었다.
- 706으로 높게 나타났다. Microsatellite 마커의 대립유전자를 이용하여 딸기 100품종에 대한 계통도를 작성하였을 때 품종 육성의 계보 및 육성 지역에 따라 7개의 그룹으로 크게 나누어졌으며 2품종을 제외한 98품종이 microsatellite 마커의 유전자형에 의해 식별이 되는 것으로 나타났다. 본 연구에서 얻어진 딸기 품종별 DNA profile 데이터베이스는 품종보호 출원 품종의 재배심사 및 품종진위성과 관련된 종자분쟁을 해결하는 수단으로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
- V 그룹은 ‘Marshall’ 등 8품종이 분포하였으며 미국에서 재배되고 있는 ‘Marshall’과 ‘Amelia’ 품종의 유전적 유사도가 높은 경향을 보였다.
- 706으로 높은 경향을 보였다. 그리고 25개의 microsatellite 프라이머 가운데 17개가 0.70 이상의 높은 PIC 값을 나타내어 본 연구에서 선발된 microsatellite 마커는 딸기 품종의 식별에 충분히 활용될 수 있을 것으로 나타났다.
- 따라서 45개의 microsatellite 정방향 프라이머의 5’-말단에 형광물질인 FAM, VIC, NED, PET 를 각각 표지하여 딸기 100품종의 genomic DNA와 PCR하고 증폭산물을 자동염기서열분석기를 이용하여 전기영동 한바, 45개 중 25개는 GeneMapper 컴퓨터 프로그램에서 검출되어진 피크가 깨끗하여 품종별 fingerprinting에 용이하였으나 나머지 20개는 아크릴아마이드 젤 분석에서 검출되지 않았던 대립 유전자가 검출되어 fingerprinting 하기에 적합하지 않은 것으로 나타나 이를 제외시켰다.
- 딸기 품종식별에 효과적인 microsatellite 마커를 선정하기 위하여, ‘Seolhyang(설향)’외 20품종을 활용하여 국제 장미작물 게놈프로젝트에서 염기서열 정보가 공개되어 있는 microsatellite primer 274개와 다형성 정도를 6% 아크릴아마이드 젤 전기영동에 의해 조사한 바(Fig. 1), 총 274개 중에서 229개는 대립유전자의 다형성을 보이지 않거나 특정 품종에서만 다형성을 보이는 양상을 보였고, 다형성을 나타내더라도 대립유전자의 양상이 복잡하였다.
- 딸기 품종식별용 마커의 선발과정에서 최종 선정된 25개의 microsatellite 프라이머와 딸기 100품종에 대한 다형성 정도를 조사한 바(Table 2), microsatellite 프라이머에 따른 검출된 대립유전자의 개수는 3-13개로 다양하게 나타났으며 총 195개의 대립유전자가 검출되었고, 마커당 평균 대립 유전자의 개수는 7.50개로 나타났다. 한편 각 마커별 공시 품종의 유전적 다형성 정도를 나타내는 지수인 PIC 값은 0.
- 이들 연구결과를 종합해 볼 때 여러 가지 유전자 분석방법 중에서 microsatellite 분석을 주로 활용하고 20-30개 내외의 microsatellite를 활용하여 100품종 이상에 대한 정밀도 높은 데이터베이스를 구축하였다는 점이다. 본 연구에서도 딸기의 품종별 DNA profile 데이터베이스 구축에 microsatellite 마커가 효과적이라는 측면에서 기존의 연구결과를 확인할 수 있었다. 한편, 본 연구에서 구축된 정밀도 높은 딸기 품종별 microsatellite 데이터베이스는 품종 보호 출원 시 DNA 검정을 먼저 실시하고 이 데이터베이스에 구축된 품종과 유전적 유사도를 비교하여 근연도가 가까운 품종을 대조품종으로 선정한다면 재배심사의 정밀도 향상에 크게 기여할 수 있을 것이다.
- 딸기 21품종을 274개의 microsatellite 마커로 검정하여 반복 재현성이 높은 25개의 다형성이 높은 마커를 선정하였다. 이들 마커와 국내외에서 재배되고 있는 딸기 100품종을 검정하였을 때 마커당 평균 대립유전자수는 7.50개로 나타났고, 3-13개까지 다양한 분포를 나타내었다. PIC 값은 마커의 유전자형에 따라 0.
- , 2013), 오이(Kwon and Choi, 2013)의 시판품종에 대하여 데이터베이스 구축에 대한 연구결과가 보고되고 있다. 이들 연구결과를 종합해 볼 때 여러 가지 유전자 분석방법 중에서 microsatellite 분석을 주로 활용하고 20-30개 내외의 microsatellite를 활용하여 100품종 이상에 대한 정밀도 높은 데이터베이스를 구축하였다는 점이다. 본 연구에서도 딸기의 품종별 DNA profile 데이터베이스 구축에 microsatellite 마커가 효과적이라는 측면에서 기존의 연구결과를 확인할 수 있었다.
- 50개로 나타났다. 한편 각 마커별 공시 품종의 유전적 다형성 정도를 나타내는 지수인 PIC 값은 0.333-0.841까지 다양한 범위에서 분포하였으며, 평균값도 0.706으로 높은 경향을 보였다. 그리고 25개의 microsatellite 프라이머 가운데 17개가 0.
후속연구
- ‘Okhyang(옥향)’과 ‘Hanun(한운)’ 품종의 경우 양친으로 활용된 품종이 I-2 그룹에 분포하는 ‘Johong(조홍)’, ‘Seolhyang (설향)’, ‘Maehyang(매향)’, ‘Akihime’ 품종이 활용되었음에도불구하고 III-2 그룹에 속한 이유는 이들 품종의 선발을 주로 중국의 운남성 원예연구소에서 수행하였는 바, 이 지역에 적합한 계통을 선발하였기 나타난 결과라고 추정되며, 향후 이들 품종에 대해서는 마커의 수와 품종별 시료를 다양화하여 정밀도 높은 분석이 필요할 것으로 사료된다.
- , 2008). 그러나 일본, 미국, 영국 및 국내에서 수행한 연구결과를 종합해 볼 때 자국에서 육성된 품종 및 유전자원을 중심으로 품종식별 체계를 구축하였기 때문에 이 결과를 활용하여 정밀도 높은 DNA profile 데이터베이스 구축에 직접 활용하기에는 어느 정도 한계가 있는 것으로 판단되었다. 따라서 국내에서 최근에 육성된 품종과 일본, 미국 등의 국가에서 재배되고 있는 품종을 추가하여 우리나라 고유의 딸기 품종별 microsatellite profile 데이터베이스 구축이 필요할 것으로 사료되었다.
- 그러나 일본, 미국, 영국 및 국내에서 수행한 연구결과를 종합해 볼 때 자국에서 육성된 품종 및 유전자원을 중심으로 품종식별 체계를 구축하였기 때문에 이 결과를 활용하여 정밀도 높은 DNA profile 데이터베이스 구축에 직접 활용하기에는 어느 정도 한계가 있는 것으로 판단되었다. 따라서 국내에서 최근에 육성된 품종과 일본, 미국 등의 국가에서 재배되고 있는 품종을 추가하여 우리나라 고유의 딸기 품종별 microsatellite profile 데이터베이스 구축이 필요할 것으로 사료되었다. 이러한 연구 결과는 품종보호 출원 품종 재배심사의 정밀도 제고, 우리나라 농업 생산물의 보호 및 지식재산권이 확보된 딸기 묘의 무단 증식 방지 등과 같은 다양한 방면에 활용도가 높을 것으로 판단된다.
- 실제로 이러한 방법을 오이, 벼 등과 같은 작물에 활용한 결과 품종의 구별성이 인정되지 않은 경우도 있어 품종보호 등록이 거절된 사례가 3건 이상 있다. 또한 재배시험 과정 중에 출원품종의 구별성, 균일성 및 안정성이 의심될 경우 본 연구에서 선정된 마커로 DNA 검정을 수행하고 검정 시료간 동일성 여부를 확인한다면 심사의 보조자료로 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 향후, 본 연구에서 선정된 딸기 품종식별용 microsatellite 마커 세트를 활용하여 실험실 및 분석기기간 교차 분석 및 블라인드 테스트를 통한 검정 기술의 표준화는 신품종 육성 시유전거리의 사전 예측이 가능하여 육종효율을 향상시킬 뿐만 아니라 국가간에 발생하는 품종보호 침해 및 딸기묘의무단 증식의 사전 예방 등과 같은 분야에 활용도가 높을 것으로 판단된다.
- 6)보다 높은 경향을 나타내었는데 이는 분석재료의 유전적 다양성이 높거나 품종 식별이 높은 마커를 1차 선발했기 때문에 나타난 결과로 판단된다. 본 연구에 최종 선정된 microsatellite 마커 25개는 지금까지 국내외에 연구자들이 품종식별에 활용하지 않았던 새로운 마커 세트로서 국외의 연구자에 의해 개발된 품종식별용 마커에 비해 대립유전자의 수는 작으나 반복 재현성이 높고 자동염기서열 분석기로 분석 시 피크의 패턴이 복잡하지 않기 때문에 향후 품종의 진위 확인과 관련된 다양한 분야에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단되 었다.
- Microsatellite 마커의 대립유전자를 이용하여 딸기 100품종에 대한 계통도를 작성하였을 때 품종 육성의 계보 및 육성 지역에 따라 7개의 그룹으로 크게 나누어졌으며 2품종을 제외한 98품종이 microsatellite 마커의 유전자형에 의해 식별이 되는 것으로 나타났다. 본 연구에서 얻어진 딸기 품종별 DNA profile 데이터베이스는 품종보호 출원 품종의 재배심사 및 품종진위성과 관련된 종자분쟁을 해결하는 수단으로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
- 따라서 국내에서 최근에 육성된 품종과 일본, 미국 등의 국가에서 재배되고 있는 품종을 추가하여 우리나라 고유의 딸기 품종별 microsatellite profile 데이터베이스 구축이 필요할 것으로 사료되었다. 이러한 연구 결과는 품종보호 출원 품종 재배심사의 정밀도 제고, 우리나라 농업 생산물의 보호 및 지식재산권이 확보된 딸기 묘의 무단 증식 방지 등과 같은 다양한 방면에 활용도가 높을 것으로 판단된다.
- VI 그룹은 ‘Nagoya-oomi’와 ‘Chunseong’, VII 그룹은 ‘Darrow’와 ‘Eastern Pine’ 품종이 각각 속하였다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 본 연구에 공시된 딸기 100품종에 대하여 25개의 microsatellite 마커를 이용하여 분석할 경우 대부분의 딸기 품종 식별이 가능하였을 뿐만 아니라 품종 육성 계보도와 각 국가별로 재배되고 있는 품종들이 마커의 유전자형에 의해 뚜렷하게 그룹화되는 경향을 보여, 본 연구에서 선정된 마커들은 품종간 유연관계 설정을 통한 유전자원 특성 평가와 품종의 진위성 확인및 조직배양 기술을 이용한 딸기의 무병묘 증식 시 변이체의 확인 등 다양한 분야에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 본 연구에서도 딸기의 품종별 DNA profile 데이터베이스 구축에 microsatellite 마커가 효과적이라는 측면에서 기존의 연구결과를 확인할 수 있었다. 한편, 본 연구에서 구축된 정밀도 높은 딸기 품종별 microsatellite 데이터베이스는 품종 보호 출원 시 DNA 검정을 먼저 실시하고 이 데이터베이스에 구축된 품종과 유전적 유사도를 비교하여 근연도가 가까운 품종을 대조품종으로 선정한다면 재배심사의 정밀도 향상에 크게 기여할 수 있을 것이다. 실제로 이러한 방법을 오이, 벼 등과 같은 작물에 활용한 결과 품종의 구별성이 인정되지 않은 경우도 있어 품종보호 등록이 거절된 사례가 3건 이상 있다.
- 또한 재배시험 과정 중에 출원품종의 구별성, 균일성 및 안정성이 의심될 경우 본 연구에서 선정된 마커로 DNA 검정을 수행하고 검정 시료간 동일성 여부를 확인한다면 심사의 보조자료로 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 향후, 본 연구에서 선정된 딸기 품종식별용 microsatellite 마커 세트를 활용하여 실험실 및 분석기기간 교차 분석 및 블라인드 테스트를 통한 검정 기술의 표준화는 신품종 육성 시유전거리의 사전 예측이 가능하여 육종효율을 향상시킬 뿐만 아니라 국가간에 발생하는 품종보호 침해 및 딸기묘의무단 증식의 사전 예방 등과 같은 분야에 활용도가 높을 것으로 판단된다.
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