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문제 정의
- 국내에서 육성된 옥수수 90 품종 및 자식 계통에 대하여 microsatellite 마커를 활용하여 DNA 프로파일 데이터베이스를 구축한 다음 공시품종에 따른 유전적 유사도 분석 및 품종식별력 검정에 대한 연구를 수행하였다. 옥수수 90품종을 100개의 microsatellite 마커로 검정하고 대립유전자의 패턴이 우수하고 다형성 정도가 높은 13개를 선정하여 분석하였을 때 대립유전자의 수는 5 ~ 24개까지 다양하게 분포하였고 평균 대립유전자의 수는 13.
- 따라서 본 연구에서는 microsatellite 마커를 활용하여 우리나라 옥수수 품종별 데이터베이스를 구축하기 위하여, 품종보호 출원 및 등록된 옥수수 90품종을 공시하여 품종 식별력이 우수한 핵심 마커의 선정 및 이를 활용한 유전적 유연관계 분석을 통한 품종식별력 검정 등에 대한 일련의 연구를 수행하여 얻어진 연구결과를 보고하는 바이다.
- 그러나 옥수수의 신품종 특성 조사에 활용된 형질 중 대부분이 환경의 영향을 많이 받는 양적형질이기 때문에 재배방법 및 환경에 따른 특정 형질의 연차간 변이, 조사자의 주관 등 여러 가지 문제점이 발생하여 정확한 대조품종의 선정이 단순하지 않았다. 이러한 문제점을 해결할 수 있는 방안이 분자생물학적 기법을 활용하여 품종별 DNA 프로파일 데이터베이스를 구축하여 식물신품종보호제도에 활용하는 것이다. 국제식물신품종보호동맹(International union for the protection of new varieties of plants; UPOV)에서는 DNA 프로파일 데이터베이스 작성에 대한 국제적 표준화를 이루기 위하여 유전자 분석 기법, 마커의 선정 기준, DNA 분리 방법 등에 대한 가이드라인을 제시하고 있다(UPOV, 2010).
제안 방법
- PCR 증폭은 94°C에서 5분간 pre- denaturation을 한 후, 94°C에서 30초간 denaturation, 55°C에서 30초간 annealing, 72°C에서 45초간 extension을 40cycle 수행하고, final extension을 72°C에 10분간 실시하였다.
- PCR증폭에 사용된 용액의 조성은 50 ng의 genomic DNA, 0.1 μM의 정방향 및 역방향microsatellite primer, 2.0 μl dNTP mixture (2.5 mM), 2.5 μl 10×PCR buffer (50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.0 mM MgCl2), 0.5U의 HS Prime Taq polymerase (G-7000, Genet Bio, Korea)에 초순수를 첨가하여 전체 부피를 30μl로 조절하였다.
- 시료 300 mg을 2.0 ml 튜브에 옮긴 다음 NucleoSpin®PlantⅡ(Cat. 740 770.250, MachereyNagel GmbH & Co., KG, Deutsch) 를 이용하여 genomic DNA를 분리 하였다.
- 신품종에 대한 배타적인 권리를 확보하기 위하여 품종보호 출원을 하면 형태적 특성 조사에 의해 신품종과 대조품종을 비교 분석하여 구별성, 균일성 및 안정성을 판단하게 된다. 신품종 심사에 활용될 대조품종의 선정은 기존 품종에 대한 특성 조사 데이터베이스를 활용하여 형태적으로 가장 유사한 품종을 선정하거나 육종가가 제시한 품종을 주로 활용하게 된다.
- 우리나라 옥수수 품종의 fingerprinting에 적합한 microsatellite 마커를 선정하기 위하여, 국제 옥수수 게놈 데이터베이스(www.maizedb.org)에서 다형성이 높은 것으로 알려진 40개와 중국에서 옥수수 품종식별에 활용된 60개의 프라이머 정방향에 형광물질(FAM, VIC, NED, PET)을 표지하여 우리나라에서 유통되고 있는 ‘횡성옥’ 등 90품종과 PCR을 수행하였다.
- 자동염기서열분석기(Genetic Analyzer 3730XL, Applied Biosystems, Foster, USA)를 활용하여 전기 영동 하기 위하여, PCR 증폭 산물 1.0 μl와 deionized formamide 10 μl, size marker (LIZ500 size standard) 0.25 μl를 혼합한 다음 PCR기기(C1000, BioRad, USA)를 이용하여 94°C에서 2분간 전처리 하였다.
- 2011)에 활용된 60개를 활용하였다. 총 100개의 프라이머 정방향에 형광물질(FAM, VIC, NED, PET)로 각각 표지한 다음 이를 DNA 프로파일 데이터베이스를 구축에 이용하였다. PCR증폭에 사용된 용액의 조성은 50 ng의 genomic DNA, 0.
- 추출된 DNA는 2.0% 아가로스젤에서 전기 영동하여 DNA 농도를 확인한 후 μl당 10 ng의 농도로 희석하여 polymerase chain reaction (PCR) 분석에 활용하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 ‘횡성옥’ 등 90개 품종 및 자식 계통의 옥수수 종자를 공시재료로 선정하였다(Table 1).
- 우리나라 옥수수의 품종지문화에 적합한 microsatellite 분자 마커를 선발하기 위하여, 국제 옥수수 게놈 데이터베이스의 정보(www.maizedb.org)를 기초하여 선정된 40개와 중국에서 옥수수 품종별 fingerprinting 분석(Wang et al. 2011)에 활용된 60개를 활용하였다. 총 100개의 프라이머 정방향에 형광물질(FAM, VIC, NED, PET)로 각각 표지한 다음 이를 DNA 프로파일 데이터베이스를 구축에 이용하였다.
- 자동염기서열분석기 3730XL을 이용하여 전기영동 하였을 때 100개의 프라이머 가운데 13개를 제외한 87개의 프라이머의 경우 다형성 정도는 높으나 대립유전자의 밴드 양상이 복잡하여 분석자의 주관에 따라 대립유전자의 크기를 오판할 우려가 있어 이를 데이터 분석에 제외하였다. 최종 선정된 13개의 마커는 옥수수 10개의 염색체중에서 3, 4, 9번 염색체를 제외한 나머지 7개의 염색체에 고르게 분포하였다. 따라서 대립유전자의 특성이 우수한 13개와 우리나라에서 육성 보급되고 있는 옥수수 90개 품종 및 자식 계통에 대한 다형성 정도를 조사한 바(Table 2), microsatellite 프라이머에 따라 검출된 대립유전자의 수는 5~22개로 다양하게 나타났으며 총 178개의 대립유전자가 검출되었고, 마커 당 평균 대립유전자의 수는 13.
데이터처리
- 25 μl를 혼합한 다음 PCR기기(C1000, BioRad, USA)를 이용하여 94°C에서 2분간 전처리 하였다. Micro-satellite 마커에 의해 증폭된 대립 유전자의 크기는 GeneMapper (version 4.1) 프로그램(Applied Biosystems, Foster, USA)을 이용하여 분석하였다.
- 그리고 NTSYSpc (version 2.10b) (Rohlf 2000) 프로그램을 이용하여 Jaccard 방법에 따라 유전적 유사도 값을 계산하였으며, 군집분석은 unweighted pair-group method with arithmetical average (UPGMA) (Sneath and Sokal 1973) 방법으로 수행한 다음 계통도를 작성하고 옥수수 품종에 따른 유전적 유연관계를 분석하였다.
이론/모형
- 공시된 옥수수 품종의 microsatellite 마커의 다형성 정도를 조사하기 위하여, Anderson 등(1993)이 제시한 공식에 준하여 polymorphism information content (PIC) 값을 산출하였다. 아래 공식에서 Pij는 마커 i의 밴드들 중에서 j번째 공통 밴드 패턴의 빈도수이다.
성능/효과
- Microsatellite 마커에 따른 옥수수 90개 품종 및 자식 계통에 대한 대립유전자의 분포 빈도 양상을 조사한 바(Fig. 1), bn1g161k8은 대립유전자의 크기가 145 bp에서 216 bp 사이에 총 22개의 대립유전자가 검출되었으며, 대립유전자의 크기가 165 bp와 183 bp에서 각각 16.8%와 18.7%의 다소 높은 빈도분포 양상을 나타내었으나, 나머지는 0.7%에서 7.1%까지 대립유전자가 고르게 분포하는 양상을 나타내었다. bn1g1671y17의 경우도 177 bp에서 250 bp 사이에 총 20개의 대립유전자가 검출되었는데 특정 대립유전자의 크기에 공시품종이 편중되지 않고 대립유전자의 크기에 따라 0.
- Microsatellite 마커의 유전자형에 따라 군집분석 하였을 때 Ⅰ그룹은 찰옥수수, 팝콘용 옥수수, 단 및 초당 옥수수 등 38개 품종 및 계통이 그룹화되었다. Ⅰ그룹을 유전적 유사도 지수 0.
- 69개로 분석되었다. Microsatellite 마커의 유전적 다형성 정도를 나타내는 지수인 PIC 값은 0.716 ~ 0.942까지 높은 범위에서 분포하였으며, 평균값도 0.865로 아주 높은 경향을 보였다. 옥수수 품종식별에 활용된 13개의 microsatellite 마커 가운데 umc1125y3과 bnlg1025y4를 제외한 11개의 마커가 0.
- 14에서 공시된 계통 및 품종은 5개의 대그룹으로 구분되었다. 그리고 공시된 모든 품종과 계통들은 microsatellite 마커의 유전자형에 의해 뚜렷하게 식별이 가능한 것으로 나타났다.
- 최종 선정된 13개의 마커는 옥수수 10개의 염색체중에서 3, 4, 9번 염색체를 제외한 나머지 7개의 염색체에 고르게 분포하였다. 따라서 대립유전자의 특성이 우수한 13개와 우리나라에서 육성 보급되고 있는 옥수수 90개 품종 및 자식 계통에 대한 다형성 정도를 조사한 바(Table 2), microsatellite 프라이머에 따라 검출된 대립유전자의 수는 5~22개로 다양하게 나타났으며 총 178개의 대립유전자가 검출되었고, 마커 당 평균 대립유전자의 수는 13.69개로 분석되었다. Microsatellite 마커의 유전적 다형성 정도를 나타내는 지수인 PIC 값은 0.
- 80 이상의 높은 PIC 값을 나타내었다. 본 연구에서 옥수수 품종 지문화 작업에 최종 활용된 microsatellite 마커의 수는 작지만 각 마커 별로 나타내는 대립유전자 수와 PIC 값이 아주 높기 때문에 우리나라에서 육성된 옥수수 품종식별 및 품종별 유전적 근연 관계를 분석하는데 효과적일 것으로 사료되었다.
- 국내에서 육성된 옥수수 90 품종 및 자식 계통에 대하여 microsatellite 마커를 활용하여 DNA 프로파일 데이터베이스를 구축한 다음 공시품종에 따른 유전적 유사도 분석 및 품종식별력 검정에 대한 연구를 수행하였다. 옥수수 90품종을 100개의 microsatellite 마커로 검정하고 대립유전자의 패턴이 우수하고 다형성 정도가 높은 13개를 선정하여 분석하였을 때 대립유전자의 수는 5 ~ 24개까지 다양하게 분포하였고 평균 대립유전자의 수는 13.69개로 높았다. PIC 값의 경우도 0.
- 옥수수 품종 및 계통 90개에 대한 microsatellite 분석에서 대립유전자의 패턴이 우수하고 PIC 값이 0.70 이상인 마커를 선발하고 이를 활용하여 군집분석에 의한 계통도를 작성한 바(Fig. 2), 공시된 품종 및 계통에 대한 전체 유사도 지수는 0.07 ~ 0.82로 나타났고, 유전적 유사도 지수 0.14에서 공시된 계통 및 품종은 5개의 대그룹으로 구분되었다. 그리고 공시된 모든 품종과 계통들은 microsatellite 마커의 유전자형에 의해 뚜렷하게 식별이 가능한 것으로 나타났다.
- 865로 아주 높은 경향을 보였다. 옥수수 품종식별에 활용된 13개의 microsatellite 마커 가운데 umc1125y3과 bnlg1025y4를 제외한 11개의 마커가 0.80 이상의 높은 PIC 값을 나타내었다. 본 연구에서 옥수수 품종 지문화 작업에 최종 활용된 microsatellite 마커의 수는 작지만 각 마커 별로 나타내는 대립유전자 수와 PIC 값이 아주 높기 때문에 우리나라에서 육성된 옥수수 품종식별 및 품종별 유전적 근연 관계를 분석하는데 효과적일 것으로 사료되었다.
후속연구
- 이상의 연구 결과를 종합해보면 본 연구에 활용된 13개의 microsatellite 마커는 옥수수 90개 품종 및 계통에 대하여 옥수수 품종 유형 및 품종 육성 계보에 따라 뚜렷하게 그룹화되는 경향을 보였기 때문에, 이는 옥수수 품종간 유연관계 설정을 통한 유전자원의 특성 평가에 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다. 그리고 13개의 microsatellite 마커에 의하여 공시품종 및 계통들이 완전하게 식별이 가능한 것으로 나타나 옥수수 품종 진위성과 관련된 종자분쟁, 농업 생산물과 관련된 도난 사건, 종자의 순도검정 등에 보조적인 수단으로 활용이 가능할 것이다. 한편, 본 연구에서는 자동염기서열분석기를 활용하여 작성된 microsatellite DNA 데이터베이스이기 때문에 신품종이 육성되면 해당 품종만 microsatellite 분석하여 기 구축된 옥수수 품종별 데이터베이스와 비교하면 신품종의 유전적 거리 예측이 가능하기 때문에 육종효율을 향상에 크게 기여할 뿐만 아니라 옥수수 유전자원의 보호 및 품종보호제도 등과 같은 신지식재산권 강화에 활용도가 높을 것으로 판단된다.
- 2015). 따라서, 우리나라 옥수수 품종 식별용 SNP 마커가 개발되고, 본 연구에서 microsatellite 마커에 의해 구축된 DNA 데이터베이스와 상호 비교하여 그 효율성이 분석된다면 옥수수 품종 확인의 정확도는 한층 더 높아질 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 구축됨 옥수수 자식계통 및 품종별 micro-satellite DNA 프로파일 데이터베이스는 신품종과 기 육성된 품종과 유전적 유사도 분석이 가능하기 때문에 품종보호출원시 대조품종 선정 및 품종진위성과 관련된 종자분쟁에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
- 이상의 연구 결과를 종합해보면 본 연구에 활용된 13개의 microsatellite 마커는 옥수수 90개 품종 및 계통에 대하여 옥수수 품종 유형 및 품종 육성 계보에 따라 뚜렷하게 그룹화되는 경향을 보였기 때문에, 이는 옥수수 품종간 유연관계 설정을 통한 유전자원의 특성 평가에 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다. 그리고 13개의 microsatellite 마커에 의하여 공시품종 및 계통들이 완전하게 식별이 가능한 것으로 나타나 옥수수 품종 진위성과 관련된 종자분쟁, 농업 생산물과 관련된 도난 사건, 종자의 순도검정 등에 보조적인 수단으로 활용이 가능할 것이다.
- 특이하게 사일리지용 옥수수인 ‘경대사일리지2호’는 독립적인 하나의 품종군으로 그룹화되지 않은 양상을 나타내었는데 이러한 원인은 품종 육성과정에 교배모본으로 활용된 계통중에 찰옥수수의 유전적 특성을 어느 정도가지고 있기 때문에 나타난 결과라고 추정되며 향후 이러한 품종 유형의 양친 및 F1에 대하여 깊이 있는 연구가 수행되어야 될 것으로 사료된다.
- 그리고 13개의 microsatellite 마커에 의하여 공시품종 및 계통들이 완전하게 식별이 가능한 것으로 나타나 옥수수 품종 진위성과 관련된 종자분쟁, 농업 생산물과 관련된 도난 사건, 종자의 순도검정 등에 보조적인 수단으로 활용이 가능할 것이다. 한편, 본 연구에서는 자동염기서열분석기를 활용하여 작성된 microsatellite DNA 데이터베이스이기 때문에 신품종이 육성되면 해당 품종만 microsatellite 분석하여 기 구축된 옥수수 품종별 데이터베이스와 비교하면 신품종의 유전적 거리 예측이 가능하기 때문에 육종효율을 향상에 크게 기여할 뿐만 아니라 옥수수 유전자원의 보호 및 품종보호제도 등과 같은 신지식재산권 강화에 활용도가 높을 것으로 판단된다.
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