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문제 정의
- 본 연구에서는 기존 연구를 재확인하고 현장에서 간단하게 발색으로 화합물의 존재여부를 확인하기 위하여 β-galactosidase 바이오센서 시스템을 제작하였다(Fig. 1).
- 본 연구에서는 현장에서 사용하기 쉬운 발색 근거 바이오센서를 제작하기 위하여 xylR-Pr-Pu와 xylR-Pr-Po’을 β-galactosidase 표지 유전자와 클로닝 하여 비교 분석하였다.
제안 방법
- BTEX 화합물 검출용 luciferase 바이오센서 플라스미드 pXRBTEX-Pu 또는 pXRBTEX-Po’ [10]을 제한효소 KpnⅠ으로 처리하고 xylR/Pr/Pu 또는 xylR/Pr/Po’가 포함된 약 2.1 kb을 분리 정제하여 같은 효소로 잘린 β-galactosidase 리포터 시스템인 6.6 kb의 pGLacZ 벡타 플라스미드에 ligation하여 약 8.7 kb의 pLZXylR 바이오센서 플라스미드를 제작하였다(Fig. 1).
- 2B). CPRG 분해로 인한 붉은색은 세포 양에 따라 다소 차이가 있으나 대략 1-2시간부터 눈으로 관찰 되었으며(OD570=0.5) 보다 높은 흡광도(~ 1)을 얻기 위하여 모든 실험에서 약 5-6시간 정도 유도 발현시켰다. 발현되는 시간은 Pu와 Po’ 모두 비슷한 양상을 나타내었다.
- CPRG와 함께 고정된 바이오센서 세포에 1 mM p-chlorotoluene을 넣고 CPRG가 분해되어 발색되는데 필요한 시간을 측정하기 위해 시간별로 흡광도를 조사하였다(Fig. 2B). CPRG 분해로 인한 붉은색은 세포 양에 따라 다소 차이가 있으나 대략 1-2시간부터 눈으로 관찰 되었으며(OD570=0.
- Luciferase 플라스미드, pXRBTEXPu, pXRBTEX-Po’로부터 xylR/Pr/Pu 또는 xylR/Pr/Po’ (약 2.1 kb)를 분리 정제하여 β-galactosidase 리포터 시스템인 pGLacZ 벡타 플라스미드(6.6 kb)에 ligation하여 pLZXylR-Pu 또는 pLZXylR-Po’ 바이오센서 플라스미드(약 8.7 kb)을 제작하였다(Fig. 1).
- pLZXylR biosensor plasmid을 갖는 재조합 E. coli DH5α를 최종농도 50 μg/ml 되도록 4 ml의 30 μg/ml 암피실린이 들어있는 TYS 배지에 접종하여 37℃에서 16 시간 진탕 배양하였다.
- pLZXylR을 갖는 바이오센서 세포의 바이오 인지 능력을 BTEX 포함하여 15개의 다양한 방향족 화합물(1 mM)에 노출 하여 조사하였다(Fig. 3). 조사에 사용된 방향족 화합물들은 benezene, toluene, ethylbenzene, o-, m-, p-xylene, o-, m-, pmethylbenzylalcohol, o-, m-, p-chlorotoluene, o-, m-, p-nitrotoluene으로 구성되었다.
- pLZXylR을 포함하는 아가로스 고정 바이오센서 세포의 안정성 검사를 위해 같은 날 같은 세포로 고정된 바이오센서 세포를 0.5 mM phosphate 완충용액(pH 7.0)으로 덮고 밀봉한 후 4℃에 보관하고 3, 7, 14, 21일에 β-galactosidase 활성을 관찰하였다.
- 결론적으로, 본 연구에서는 BTEX 분해 조절단백질 xylR 유전자와 두 프로모터(Pu 또는 Po’)를 β-galactosidase 표지 유전자와 결합하고 아가로스에 고정하여 방향족 화합물에 대한 반응성을 비교 분석하였다.
- 또한 높은 반응성을 보이는 o-, m-, p-chlorotoluene과 o-, m-, p-nitrotoluene은 다양한 농도 범위(0.1 μM-100 mM)에서 반응을 관찰하였다.
- 약 30-50 μl 세포와 아가로스(0.2%, 40℃)를 1:1 혼합하여 96-wells microplate에 β-galactosidase 기질인 CPRG (3 mM)와 함께 고정하였다.
- 양끝말단이 동일한 제한효소 KpnⅠ으로 cloning 되었으므로 원하는 방향임을 확인하기 위해 RV3 primer와 Pu-R primer을 이용하여 PCR을 수행하거나 β-galactosidase의 발색반응으로 올바르게 클로닝된 콜로니를 선별하였다.
- 현장 시료 분석을 위하여 아가로스에 고정된 바이오센서 세포를 포함하는 96-wells microplates을 현장에서 전처리 없이 폐수에 노출한 후 눈으로 발색을 확인하거나 실험실로 가져와 microplate reader로 흡광도를 읽어 정량하였다. 양성 데이터를 얻기 위하여 폐수를 1:1로 희석한 후 반응성을 보이는 1 mM o-, m-, p-chlorotoluene와 o-, m-, p-nitrotoluene을 spike하여 고정된 바이오센서로 측정한 결과를 같은 화합물로 spike한 완충용액 결과와 비교하였다. pLZXylR을 포함하는 아가로스 고정 바이오센서 세포의 안정성 검사를 위해 같은 날 같은 세포로 고정된 바이오센서 세포를 0.
- 유도 화합물에 의한 모든 바이오센서 반응은 바탕실험에서 나타나는 β-galactosidase 반응을 보정하여 나타내었다.
- 이 문제를 해결하기 위하여 xylR 유전자를 UASs을 제거한 돌연변이 Po’ 또는 Ps 프로모터와 함께 luciferase 표지 유전자와 클로닝 하였으며, Po’에서 가장 적은 바탕 활성과 큰 반응을 얻었다[10].
- 이 플라스미드들을 대장균 DH5α에 형질전환하고 아가로스와 β-galactosidase 기질인 CPRG와 함께 96-wells microplate에 고정하여 β-galactosidase 발색근거 바이오센서 시스템을 구축하고 그 반응 결과를 luciferase 시스템과 또는 두 프로모터간에 비교 분석하였다.
- 분석물질에 BTEX 유도 화합물이 존재할 경우, XylR 조절단백질이 활성화되고 조절단백질은 프로모터와 반응하여 downstream에 위치한 β-galactosidase을 발현하며 기질 CPRG는 분해되어 노란색에서 붉은색으로 발색된다. 이를 현장에서 눈으로 확인하거나 microplate reader에 의해 정량적으로 분석하였다.
- 최적 실험 조건을 결정하기 위해 다양한 세포수(10-80 μl) 및 색발현시간(1-6 hr)을 조사하였다.
- 최적의 실험조건을 구하기 위하여 세포수와 발현시간을 조사하였다(Fig. 2A, 2B). 세포의 양이 증가할수록 β-galactosidase에 의한 분해가 증가하여 흡광도가 증가하였다(Fig.
- 5). 폐수에 o-, m-, p-chlorotoluene, o-, m-, p-nitrotoluene을 spike한 후에 고정된 바이오센서 세포에 주입하여 발색을 확인하였다. 바이오센서 세포는 실험실 완충용액에서와 같이 폐수에 spike된 화합물들을 인지하며 비슷하거나 약간 낮은 반응을 나타내었다(Fig.
- 플라스미드 pLZXylR 함유 바이오센서 세포를 현장에서 활용하기 위하여 환경 폐수 중에서도 이러한 o-, m-, p-chlorotoluene, o-, m-, p-nitrotoluene 화합물들을 인지하는지 조사하였다(Fig. 5). 폐수에 o-, m-, p-chlorotoluene, o-, m-, p-nitrotoluene을 spike한 후에 고정된 바이오센서 세포에 주입하여 발색을 확인하였다.
- 플라스미드 pLZXylR을 갖는 바이오센서의 안정성 조사를 하였다(Fig. 6). 플라스미드 pLZXylR을 포함하는 아가로스 고정 바이오센서 세포를 0.
- 플라스미드 pLZXylR을 포함하는 아가로스 고정 바이오센서 세포를 0.5 mM phosphate 완충용액(pH 7.0)으로 덮고 밀봉한 후 4℃에 보관하고 21일간 β-galactosidase 활성을 검사하였다.
- 현장 시료 분석을 위하여 아가로스에 고정된 바이오센서 세포를 포함하는 96-wells microplates을 현장에서 전처리 없이 폐수에 노출한 후 눈으로 발색을 확인하거나 실험실로 가져와 microplate reader로 흡광도를 읽어 정량하였다. 양성 데이터를 얻기 위하여 폐수를 1:1로 희석한 후 반응성을 보이는 1 mM o-, m-, p-chlorotoluene와 o-, m-, p-nitrotoluene을 spike하여 고정된 바이오센서로 측정한 결과를 같은 화합물로 spike한 완충용액 결과와 비교하였다.
- 현장에서 보다 간단하고 신속한 반응을 위하여 β-galactosidase 기질인 CPRG (3 mM)와 함께 고정하여 현장 시료만 주입하여 발색으로 관찰하게 하였다.
대상 데이터
- 아가로스는 USB corporation (Cleveland, OH, USA)에서, 배지와 agar는 Difco회사(Kansas, MO, USA)에서 구입하였다. CPRG와 BTEX 화합물, 암피실린은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 플라스미드 DNA 정제 키트는 Qiagen(Hilden, Germany)에서, pGL3 basic vector와 pSV-βgal vector은 Promega (Madison, WI, USA)에서, 각종 제한효소들, T4-DNA ligase는 Takara (Shiga, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
- Po’와 Pu 모두 비슷한 결과를 보여주었으며 세포는 직선구간에 있는 30-50 μl를 최적 세포량으로 모든 실험에서 사용하였다(Fig. 2A).
- 아가로스는 USB corporation (Cleveland, OH, USA)에서, 배지와 agar는 Difco회사(Kansas, MO, USA)에서 구입하였다. CPRG와 BTEX 화합물, 암피실린은 Sigma (St.
- 3). 조사에 사용된 방향족 화합물들은 benezene, toluene, ethylbenzene, o-, m-, p-xylene, o-, m-, pmethylbenzylalcohol, o-, m-, p-chlorotoluene, o-, m-, p-nitrotoluene으로 구성되었다. Po’와 Pu 모두 o-, m-, p-chlorotoluene, o-, m-, p-nitrotoluene에 반응성을 보여주었으며 Po’ 가 o-, m-, p-chlorotoluene에서 Pu와 거의 비슷하거나 약간 높은 반응을 보이나 o-, m-, p-nitrotoluene에서는 약 2배 정도 더 높은 반응성을 보였다.
- 플라스미드 DNA 정제 키트는 Qiagen(Hilden, Germany)에서, pGL3 basic vector와 pSV-βgal vector은 Promega (Madison, WI, USA)에서, 각종 제한효소들, T4-DNA ligase는 Takara (Shiga, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 또한 세포 반응은 통계적으로 받아들일 수 있는 표준편차(±4.2%; n=6)로 재현성을 나타내었다.
이론/모형
- 양끝말단이 동일한 제한효소 KpnⅠ으로 cloning 되었으므로 원하는 방향임을 확인하기 위해 RV3 primer와 Pu-R primer을 이용하여 PCR을 수행하거나 β-galactosidase의 발색반응으로 올바르게 클로닝된 콜로니를 선별하였다. 플라스미드는 Qiagen spin column 키트로 정제하였으며 클로닝, ligation, 형질전환은 표준 방법으로 수행하였다[13].
성능/효과
- BTEX 방향족 화합물 중에서 o-, m-, pchlorotoluene (0.1 μM-100 mM), o-, m-, p-nitrotoluene (0.1 mM-100 mM) 화합물들에 큰 반응을 보였으며 기존 luciferase 시스템과 같이 Po’ 프로모터가 Pu에 비해 더 높은 반응을 나타내었으며, 기존 luciferase 시스템에 비해 높은 농도에서의 활성을 보여 luciferase 시스템을 보완하여 활용될 수 있음을 제시하였다.
- Po’가 Pu에 비해 보다 높은 반응성을 나타내었으며, 특히 o-, p-chlorotoluene에서 가장 높은 반응성을 보여 주었다.
- Po’와 Pu 모두 o-, m-, p-chlorotoluene, o-, m-, p-nitrotoluene에 반응성을 보여주었으며 Po’ 가 o-, m-, p-chlorotoluene에서 Pu와 거의 비슷하거나 약간 높은 반응을 보이나 o-, m-, p-nitrotoluene에서는 약 2배 정도 더 높은 반응성을 보였다.
- 1 mM-100 mM) 화합물들에 큰 반응을 보였으며 기존 luciferase 시스템과 같이 Po’ 프로모터가 Pu에 비해 더 높은 반응을 나타내었으며, 기존 luciferase 시스템에 비해 높은 농도에서의 활성을 보여 luciferase 시스템을 보완하여 활용될 수 있음을 제시하였다. 아가로스에 고정된 바이오센서는 4℃에서 21일간 보존 후에도 안정적인 반응을 보였으며 chlorotoluene과 nitrotoluene 화합물로 spike한 폐수 시료 중에서도 전처리 없이 활용될 수 있음을 보여주어 폐수 중 chlorotoluene과 nitrotoluene 화합물의 간단한 초기 검출에 활용될 수 있음을 보여주었다.
- Po’가 Pu에 비해 보다 높은 반응성을 나타내었으며, 특히 o-, p-chlorotoluene에서 가장 높은 반응성을 보여 주었다. 이 결과는 pLZXylR을 갖는 바이오 센서가 현장폐수에서의 화합물 초기검출(존재유무)에 이용될 수 있음을 보여준다. 세포 바이오센서는 독성물질의 독성 및 생유용성 등 다양한 양상을 나타내는 것으로 알려져 있으며[8], 정밀검출보다는 초기검출에 활용되어지며 따라서 보다 정확한 페놀계 화합물의 농도결정에는 정밀한 기기분석이 필요하다.
- 이러한 반응성의 차이점은 다른 논문에서도 나타나는데 Willardson 그룹[20]은 pGL3 basic vector 대신 pGL2를 사용하였으며 p-methylbenzylalcohol과 ethylbenzene이 Pu에 의해 인지되지 않는다고 보고하였다[20]. 종합적으로, 본 연구에서 제작한 pLZXylR 두 프로모터 시스템은 지난 연구에서 검출이 되지 않거나 약한 o-, m-, pchlorotoluene, o-, m-, p-nitrotoluene의 검출에 특이적으로 반응함을 보여주었다(Fig. 3).
후속연구
- 따라서 본 연구에서 제작한 β-galactosidase 시스템은 luciferase 시스템을 보완하며 비교적 높은 농도범위에서 o-, m-, p-chlorotoluene, o-, m-, p-nitrotoluene의 검출에 활용될 수 있다.
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