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문제 정의
- 본 연구에서는 Aplysina aerophoba와 같은 Ceractinomorpha 아강(subclass)에 속하는 Axinella sp. 공생 미생물의 16S rDNA 염기서열을 이용하여 100 ppm HBB의 영향에서 생존 가능한 미생물의 다양성을 분석하고자 한다. 이는 향후에 dehalogenase 효소 생산이 가능한 미생물 탐색에 활용될 수 있을 것이다.
제안 방법
- 0 U ExTaq polymerase (Takara, Japan)로 구성되었다. PCR 반응은 T1 Thermocycler (Biometra, Germany)를 이용하여 94℃에서 5분 반응 후, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분씩 35회 반복 반응시켰으며 마지막에 72℃에서 7분간 더 반응을 진행하였다. PCR 산물인 1.
- PCR 반응은 T1 Thermocycler (Biometra, Germany)를 이용하여 94℃에서 5분 반응 후, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분씩 35회 반복 반응시켰으며 마지막에 72℃에서 7분간 더 반응을 진행하였다. PCR 산물인 1.5 Kb 크기의 DNA 절편은 0.8% agarose gel에서 확인한 다음 AccuPrepⓇ PCR Purification system(Bioneer, Korea)을 이용하여 정제하였다.
- 무작위로 선별된 클론의 콜로니 PCR은 선별된 클론을 주형으로 하여 primer T7(5'-TAA ATC CAA GAA TTT CAC C-3')과 SP6 (5'-ATT TAG GTG ACA CTA TAG AA-3')를 이용하여 수행되었다.
- 배양 시료 1 mL의 genomic DNA는 QIAGEN DNeasyⓇ Tissue kit로 추출하였고, Nano Drop(Nanodrop, USA)과 0.8% agarose gel을 이용하여 genomic DNA의 양을 정량분석 하였다.
- 동일 배지에 1주일 간격으로 5주 동안 계대되어 배양되었다. 본 연구에는 1주, 3주, 5주차 배양액이 이용되었다.
- 증폭된 16S rDNA 산물은 96 well NucleoFast PCR prep system(MN, Germany)을 이용하여 정제되었고, 518R(5'-GTA TTA CCG CGG CTG CTG G) primer와 ABI PRISMⓇ BigDyeⓇ Terminator v3.1 Cycle sequencing Kit(PE Applied Biosystems, USA)로 제조사의 방법에 따라 반응시켰다.
- 1 Cycle sequencing Kit(PE Applied Biosystems, USA)로 제조사의 방법에 따라 반응시켰다. 최종적으로 알콜로 세척시킨 다음 ABI PRISM 3100 automated sequencer(PE Applied Biosystems, USA)로 유전자 서열을 분석하였다.
- 한편 MVSP ver. 3.0 (Kovach, UK)을 이용하여 각 시료간의 유사도를 분석하였다.
대상 데이터
- 배양에 사용한 배지는 anaerobic chamber(COY Lab)에서 무산소상태로 만들어진 Marine Broth 2216으로 만들어진 UTC Broth (Untreated Control Broth)와 UTC Broth에 HBB 100 ppm이 첨가된 HBB Broth 두 종류가 사용되었다. 시료로는 남태평양 마이크로네시아 연방공화국 축(Chuuk)주에서 채집된 해면(Axinella sp.
- 배양에 사용한 배지는 anaerobic chamber(COY Lab)에서 무산소상태로 만들어진 Marine Broth 2216으로 만들어진 UTC Broth (Untreated Control Broth)와 UTC Broth에 HBB 100 ppm이 첨가된 HBB Broth 두 종류가 사용되었다. 시료로는 남태평양 마이크로네시아 연방공화국 축(Chuuk)주에서 채집된 해면(Axinella sp.)이 이용되었는데, 해면 체액 1 mL씩을 무산소 UTC Broth와 HBB Broth에 접종하여 25℃에서 배양시켰다. 동일 배지에 1주일 간격으로 5주 동안 계대되어 배양되었다.
- 추출된 genomic DNA의 16S rDNA는 세균 도메인의 보전 염기서열을 기초로 제작된 27F(5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3‘) primer와 1518R(5'-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3’) primer를 이용하여 증폭되었다.
데이터처리
- Cluster analysis using UPGMA clustering method based on Pearson's correlation coefficient similarity.
- 5c; [6]) 프로그램이 내장된 PHYDIT 프로그램을 이용하여 2차구조 기반으로 정열시키고 Juke and Cantor distance [10] algorithm과 Neighbor-Joining [17] 방법으로 계통분석을 실시하였다. 계통도의 각 분기점의 지지도는 1,000번의 bootstrap 분석을 실시하여 검증하였다 [5].
- 얻어진 약 400 base의 16S rDNA 염기서열은 BLAST 분석 툴 [2]을 이용하여 NCBI의 GenBank에 등록된 서열 중 가장 유사도가 높은 서열을 검색하였으며 PHYLIP(Version 3.5c; [6]) 프로그램이 내장된 PHYDIT 프로그램을 이용하여 2차구조 기반으로 정열시키고 Juke and Cantor distance [10] algorithm과 Neighbor-Joining [17] 방법으로 계통분석을 실시하였다. 계통도의 각 분기점의 지지도는 1,000번의 bootstrap 분석을 실시하여 검증하였다 [5].
이론/모형
- DH5α에 형질전환 되었으며 ampicillin (100 ㎍/㎕)이 포함된 LB(Difco Co., USA) 평판배지에서 blue-white colony 선별법에 의해 white 클론이 선별되었다.
성능/효과
- α-Proteobacteria인 Xanthobacter autotrophicus로부터는 haloalkane dehalogenase gene과 결정구조가 밝혀졌지만 [7, 9], 본 연구 결과 α-Proteobacteria와 γ-Proteobacteria는 각각 1개, 2개의 클론만이 검출됨으로써 배양 시간과 HBB 영향의 존재 여부를 판단하기 어려웠으나 (Fig 1) 이들 분류군에 속하는 세균이 해면에서의 혐기적 dehalogenation에 관여하지는 않을 것으로 추정된다.
- Bacteriodetes문에 속하는 미생물 클론들은 모두 Bacteroidia강에 속하며 해양미생물로 이루어진 Marinilabiliaceae, Draconibacteriaceae 등의 과에 속하였다. 또한 해면이나 산호에서 발견된 클론들과 높은 유사도를 보임으로써 이들은 해면 [13] 산호 [20, 22]등의 해양생물과 공생관계에 있는 것으로 추정된다.
- Cluster 분석 결과는 1주차 HBB 시료의 세균군집이 현저하게 다른 것으로 나타났으며(Fig. 3) HBB가 없는 경우에도 1주차 미생물군집이 다른 시료에 비해 차이가 큰 것으로 나타났다. 이상의 결과는 HBB 첨가는 아마도 초기 1주간에 심각한 영향을 미치지만 이후 배양환경의 변화가 미생물 군집 구조에 더 큰 영향을 미쳤을 가능성을 시사한다.
- HBB가 첨가되지 않은 배지로부터 얻어진 클론 중 1주차(ck02) 클론은 C. stercorarium, D. marinisediminis, E. oxidoreducens, F. paucivorans, 산호클론 STX_42, P. rosenbergii, 클론 SGUS930와 유사도가 높은 8개 계통군으로, 3주차(ck04) 클론은 산호공생 세균 클론 (AF365547), D. marinisediminis, E. oxidoreducens, 산호클론 STX_42, 클론 SGUS930와 유사도가 높은 5개 계통군으로, 5주차(ck06) 클론은 D. marinisediminis, 산호클론 STX_42, 클론 SGUS930와 유사도가 높은 3개 계통군으로 나누어졌다(Fig. 1, Table 2).
- Planctomyceta에 속하는 클론은 모두 2개였으며 HBB가 있는 경우에 검출되었다(Fig. 1, 2). 또한 이들은 수족관으로 옮긴 해면에서 검출된 것으로 보아 해면의 공생미생물인 것으로 추정된다 [14].
- 각각의 시료 중 1주차 62개(ck01와 ck02), 3주차 78개(ck03와 ck04), 5주차 85개(ck05와 ck06) 등 총 225개의 클론 염기서열을 얻었다(Table 1 과 2). 각 주차 배지별로 97% 유사도를 기준으로 클론들을 정리하고 Rarefaction curve를 그렸을 때 그래프가 포화곡선에 가까웠으므로 (자료 미제시) 충분한 샘플이 확보되었음을 확인할 수 있었다 [11, 18].
- 검출된 Firmicutes 클론은 모두 Clostridia강에 속했으며 HBB 유무에 따라, 또 종에 따라 시간경과에 대해 다른 반응을 보였다. Fusibacter paucivorans [15]와 유사도가 높은 클론들(Fig.
- HBB의 영향을 받은 1주차(ck01) 클론들은 Desulfovibrio marinisediminis [24], Lissodendoryx sp. 공생세균 클론 291P, Fusibacter paucivorans, 산호 공생세균 클론 SGUS930, Eubacterium oxidoreducens, human intestinal firmicute CO39와 유사도가 높은 7개 계통군으로, 3주차(ck03) 클론은 D. marinisediminis, E. oxidoreducens, 클론 SGUS930, 산호공생 세균 클론 (AF365547), 비배양 Planctomycetales와 유사도가 높은 5개 계통군으로 나누어졌고, 5주차(ck05) 클론은 D. marinisediminis, E. oxidoreducens, Photobacterium rosenbergii, Pseudovibrio denitrificans, Vallitalea guaymassensis, 비배양 Planctomycetales, 클론 SGUS930와 유사도가 높은 7개 계통군으로 나누어졌다(Fig. 1, Table 1).
- 남태평양에 위치하는 마이크로네시아 연방공화국 축(Chuuk)주에서 채집된 해면(Axinella sp.)의 복강 체액을 무산소상태에서 100 ppm의 HBB를 주었을 때 HBB가 주어지지 않은 조건과 비교하여 Deltaproteobacteria에 속하는 Desulfovibrio marinisediminis가 우점한다는 점에서 동일하였으나 HBB에 의하여 Lentisphaerae에 속하는 미생물이 사멸한다는 점과 Clostridia강 미생물의 경우 HBB 유무에 따라 검출되는 종에 차이를 보였다. 또한 보고된 자료와 비교하였을 때 halogenation/ dehalogenation 관련 유전자를 확보하기 위해서는 D.
- TBP-1과 매우 높은 유사도를 보여 이들 그룹은 HBB의 영향을 받지 않는 것으로 추정된다(Fig 1, 2). 또한 전체 클론 중 70.7%를 차지하였으며 1주차보다 3주차 이후에 우점도가 높아지는 것으로 볼 때 주어진 배양조건에 가장 잘 적응한 분류군인 것으로 생각된다. 한편 Desulfovibrio sp.
- 또한 Clostridium oroficum과 유사도가 높은 클론은 HBB 배지에서 5주차에만 검출되었다 (Table 1, 2). 이상의 결과는 Fusibacter 계통 미생물의 경우 해면 복강 내에 존재하지만 Deltaproteobacteria의 번성에 따라 사멸하는 반면, Vallitalea 계통 미생물은 미약하지만 HBB에 내성을 가지고 시간 경과에 따라 증가하는 것임을 시사한다(Fig 1, 2).
- 3) HBB가 없는 경우에도 1주차 미생물군집이 다른 시료에 비해 차이가 큰 것으로 나타났다. 이상의 결과는 HBB 첨가는 아마도 초기 1주간에 심각한 영향을 미치지만 이후 배양환경의 변화가 미생물 군집 구조에 더 큰 영향을 미쳤을 가능성을 시사한다.
- 남태평양에 서식하는 Axinella sp. 해면에 공생하는 Deltaproteobacteria는 동일 아강에 속하는 해면인 Aplysina aerophoba 공생 미생물의 분포 [1]와 일치하는 결과를 보였다.
후속연구
- 공생 미생물의 16S rDNA 염기서열을 이용하여 100 ppm HBB의 영향에서 생존 가능한 미생물의 다양성을 분석하고자 한다. 이는 향후에 dehalogenase 효소 생산이 가능한 미생물 탐색에 활용될 수 있을 것이다.
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