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문제 정의
- 본 연구는 14일 반복투여독성평가에 따른 사망률, 임상증상, 음수율, 식이율, 체중 및 장기 중량 변화, 혈액학적 검사 및 혈액생화학적 검사, 해부병리학적 조직검사 등을 암수별 시험군으로 나누어 수행함으로써 연구결과에 대한 근거를 명확하게 제시하고자 하였다
- 이에 본 연구에서는 한약처방 및 화장품의 원료로 빈번하게 사용되는 택사의 안전성에 대한 과학적 근거를 확보하기 위해 식품의약품안전청 ‘비임상시험관리기준(식약청고시 제2012-61)’ 및 ‘의약품등의 독성시험기준(식약청고시 제2012-86)’에 따라 반복투여 독성시험을 수행하였다.
제안 방법
- 1) 본 시험물질은 임상 적용 시 경구를 통하여 섭취하고 있으므로, 시험물질과 용매대조물질을 존데를 이용하여 경구로 투여하였다.
- 2) 시험물질 및 용매대조물질은 투여 전 체중을 측정하여 투여량(10 ㎖/㎏)을 환산하여, 1일 1회, 14일간 연속으로 투여하였다.
- 3) 시험물질을 투여한 모든 동물에 대하여 1일 2회(오전 10:00 이전, 오후 14:00 이후) 빈사동물 및 사망여부를 확인하였고, 외관적 이상 및 임상증상, 이상 징후의 발생여부와 그 정도를 관찰하였다.
- 4) 부검 : 계획도살 동물에 대하여 혈액학적 검사를 실시하였다. 동물을 하룻밤 절식시킨 후 동물전용마취제(Zoletil 50, ㈜ 버박코리아)로 마취 후 개복하여, 복대동맥을 방혈 및 치사시켜 장기조직을 육안으로 검사하였다.
- 4) 부검 : 계획도살 동물에 대하여 혈액학적 검사를 실시하였다. 동물을 하룻밤 절식시킨 후 동물전용마취제(Zoletil 50, ㈜ 버박코리아)로 마취 후 개복하여, 복대동맥을 방혈 및 치사시켜 장기조직을 육안으로 검사하였다.
- 장기중량을 측정했던 장기들을 10% 중성포르말린용액(neutral formalin)에 고정하였다. 대조군과 2,000㎎/㎏ 투여군의 장기에 대하여 조직검체를 제작하였다. 조직은 3㎜로 삭정하고, 일반적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀으로 고정 처리한 뒤, 1~4㎛의 조직절편을 제작하였다.
- 계획도살 동물에 대하여 혈액학적 검사를 실시하였다. 동물을 하룻밤 절식시킨 후 동물전용 마취제(Zoletil 50, (주)버박코리아)로 마취 후 개복하여, 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 이용하여 다음의 항목을 측정하였다(Table 3).
- 4) 부검 : 계획도살 동물에 대하여 혈액학적 검사를 실시하였다. 동물을 하룻밤 절식시킨 후 동물전용마취제(Zoletil 50, ㈜ 버박코리아)로 마취 후 개복하여, 복대동맥을 방혈 및 치사시켜 장기조직을 육안으로 검사하였다.
- 부검 후 다음의 장기를 적출하여 전자저울을 이용하여 측정하였으며, 실측치(절대중량)를 측정하고, 체중에 대한 비(상대중량)도 계산하였다. 또한, 양측정 장기는 모두 측정하였다(Table 4).
- 혈액학적 검사를 실시한 동물에 대하여 혈청생화학적 검사를 실시하였다. 복대동맥으로부터 채혈된 혈액을 3,000 rpm, 15분간 원심분리하여 얻은 혈청을 이용하여 다음과 같은 항목에 대해 측정하였다(Table 2)
- 이에 따르면 강제경구 투여 시 기술적으로 투여하는 용량은 1,000~2,000 ㎎/㎏이며, 단회투여독성시험의 결과를 참고하여 최고용량은 2,000 ㎎/㎏으로 설정하였다. 본 시험에서는 고용량 2,000 ㎎/㎏을 포함하여 저용량 500 ㎎/㎏과 중용량 1,000 ㎎/㎏으로 설정하여, 총 3단계의 용량을 처리하기로 하였다.
- 본 연구에서는 택사의 일반적인 경구투여에서 가장 빈번하게 나타나는 열수추출물에 대한 실험을 진행하였으며, 이를 위하여 택사 500g을 추출기에 넣고 증류수를 4ℓ를 넣은 후, 약110°C로 4시간동안 추출하고 나온 추출액을 병에 담았다.
- 부검 후 다음의 장기를 적출하여 전자저울을 이용하여 측정하였으며, 실측치(절대중량)를 측정하고, 체중에 대한 비(상대중량)도 계산하였다. 또한, 양측정 장기는 모두 측정하였다(Table 4).
- 0 g/㎏의 택사 물추출물을 각각 14일 반복투여한 후, 부검을 실시하였다. 부검 후 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 원심분리하여 얻은 혈청을 이용하여 아스파테이트 아미노기전이효소(AST), 알라닌 아미노기전이효소(ALT), 젖산 탈수효소(LDH) 등을 측정하였다. 그 결과 0.
- 0 g/㎏의 택사 물추출물을 각각 14일 반복투여한 후, 부검을 실시하였다. 부검 후 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 이용하여 백혈구수(WBC), 적혈구수(RBC), 혈색소량(HGB) 등을 측정하였다. 그 결과 대조군과 시험물질 투여군 간의통계적인 유의성을 관찰 할 수 없었다(Table 9).
- 사료(실험동물용 고형사료)와 물은 자유롭게 먹도록 유지하며, 사육장의 온도는 21~24°C, 상대습도는 40~80%로 유지하고, 12시간마다 낮과 밤이 반복되도록 사육장 내 빛을 조절하여 사육하였다.
- 수컷 Rat에 0, 0.5, 1.0, 2.0 g/㎏의 택사 물추출물을 각각 14일 반복투여한 후, 부검을 실시하였다. 부검 후 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 이용하여 백혈구수(WBC), 적혈구수(RBC), 혈색소량(HGB) 등을 측정하였다.
- 순화기간 후 Rat를 군 분리하여 0, 0.5, 1.0, 2.0 g/㎏의 택사 물추출물을 각각 14일간 반복경구투여한 후, 부검을 실시하였다. 수컷 Rat의 부검 시 체중은대조군은 260.
- 암컷 Rat에 0, 0.5, 1.0, 2.0 g/㎏의 택사 물추출물을 각각 14일 반복투여한 후, 부검을 실시하였다. 부검 후 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 이용하여 백혈구수(WBC), 적혈구수(RBC), 혈색소량(HGB) 등을 측정하였다.
- 본 연구에서는 택사의 일반적인 경구투여에서 가장 빈번하게 나타나는 열수추출물에 대한 실험을 진행하였으며, 이를 위하여 택사 500g을 추출기에 넣고 증류수를 4ℓ를 넣은 후, 약110°C로 4시간동안 추출하고 나온 추출액을 병에 담았다. 열이 적당히 식으면 여과지로 여과하여 냉동으로 보관하고 추출액을 감압농축기로 농축을 실시하였다. 농축된 시료를 동결건조기로 약 3일 동안 동결건조 하여 수득률 23.
- 대조군과 2,000㎎/㎏ 투여군의 장기에 대하여 조직검체를 제작하였다. 조직은 3㎜로 삭정하고, 일반적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀으로 고정 처리한 뒤, 1~4㎛의 조직절편을 제작하였다. 최종적으로 Hematoxylin & Eosin Stain을 거쳐 광학현미경으로 관찰하였다.
- 최종적으로 Hematoxylin & Eosin Stain을 거쳐 광학현미경으로 관찰하였다.
- 택사 물추출물을 14일 반복투여한 후, 부검을 실시하였다. 부검 후 적출한 모든 장기를 조직병리로 판독한 결과, 대조군과 시험물질 투여군 간의 유의성 있는 차이점은 관찰할 수 없었다(Fig.
- 혈액학적 검사를 실시한 동물에 대하여 혈청생화학적 검사를 실시하였다. 복대동맥으로부터 채혈된 혈액을 3,000 rpm, 15분간 원심분리하여 얻은 혈청을 이용하여 다음과 같은 항목에 대해 측정하였다(Table 2)
대상 데이터
- 열이 적당히 식으면 여과지로 여과하여 냉동으로 보관하고 추출액을 감압농축기로 농축을 실시하였다. 농축된 시료를 동결건조기로 약 3일 동안 동결건조 하여 수득률 23.7%로 택사추출물 23.5㎎을 얻었으며 이를 실험에 사용하였다.
- 동물은 생후 7주된 150~180g의 SD(Sprague Dawley) Rat를 (주)오리엔트바이오에서 구입하여 2주간 안정시킨 뒤 실험동물로 사용하였다. 사료(실험동물용 고형사료)와 물은 자유롭게 먹도록 유지하며, 사육장의 온도는 21~24°C, 상대습도는 40~80%로 유지하고, 12시간마다 낮과 밤이 반복되도록 사육장 내 빛을 조절하여 사육하였다.
- 본 연구에 사용된 택사(Alismatis Rhizoma)는 (주)퓨어마인드(yongchoen, Korea)에서 구입하였으며, 대한약전 및 생약규격집을 근거로 중앙약사심의위원회 한약분과 감별위원의 감별을 받아 사용하였다.
- 순화기간 중 건강한 것으로 판정된 동물들의 체중을 측정하고, 평균체중에 가까운 동물들을 암수 각각160 마리씩 선택하였다. 선택한 동물들은 순위화한 체중에 따라 ‘시험군의 구성’표에 명시된 동물수가 되도록 하였다.
데이터처리
- 본 시험에서 얻은 측정치들은 ANOVA 분석을 실시한 후, 유의성이 인정될 경우 Dunnett's t-test를 실행하여 대조군과 각 용량군 간의 통계학적 유의성을 검정하였다(p < 0.05).
이론/모형
- 본 시험은 ‘비임상시험관리기준(식약청고시 제2012-61)’ 및 ‘의약품등의 독성시험기준(식약청고시 제2012-86)’을 바탕으로 실험을 수행하였다.
성능/효과
- 결과에서 알 수 있듯이 시험기간 중 사망한 개체가 없어 LD50의 산출은 불가하였으며, 기본적인 임상증상이나 이상 소견은 관찰되지 않았다. 그러나 체중의 변화에 있어서 수컷 Rat의 저농도인 0.
- 부검 후 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 원심분리하여 얻은 혈청을 이용하여 아스파테이트 아미노기전이효소(AST), 알라닌 아미노기전이효소(ALT), 젖산 탈수효소(LDH) 등을 측정하였다. 그 결과 0.5g/㎏/day 투여군과 1.0g/㎏/day 투여군에서 유의성있는 변화가 관찰되었다(Table 11).
- 부검 후 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 원심분리하여 얻은 혈청을 이용하여 아스파테이트 아미노기전이효소(AST), 알라닌 아미노기전이효소(ALT), 젖산 탈수효소(LDH) 등을 측정하였다. 그 결과 대조군과 비교하여 1.0g/㎏/day 투여군에서 AST 수치가 소폭 증가하였으며, LDH 수치는 특이적으로 증가되었다(Table12).
- 결과에서 알 수 있듯이 시험기간 중 사망한 개체가 없어 LD50의 산출은 불가하였으며, 기본적인 임상증상이나 이상 소견은 관찰되지 않았다. 그러나 체중의 변화에 있어서 수컷 Rat의 저농도인 0.5g/ ㎏에서 유의성 있는 체중의 증가가 관찰되었으며, 암컷 Rat에서도 저농도에서의 체중증가가 두드러지게 나타났다. 이러한 결과는 택사의 약리작용이 농도에 따라 차이를 보일 수 있을 것으로 생각되며, 추가적인 연구가뒷받침 되어야 할 것으로 보인다.
- 이러한 결과는 택사의 약리작용이 농도에 따라 차이를 보일 수 있을 것으로 생각되며, 추가적인 연구가뒷받침 되어야 할 것으로 보인다. 또한 개별 장기의 중량변화에 있어서는 대조군과 비교하여 수컷 Rat의 고환무게가 저농도에서 유의성 있게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이는 택사가 전통적으로 비뇨생식기에 작용하는 약물임을 이해하는데 의미 있는 데이터로 간주할 수 있다.
- 05 g 이며, 시험물질 투여로 인한 유의성 있는 체중변화는 관찰되지 않았다. 또한 부검 시 장기중량 및 상대중량을 측정한 결과, 대조군과 시험물질 투여군 간에 통계학적인 유의성을 관찰할 수 없었다(Table 7,8).
- 07 g 이며, 시험물질 투여로 인한 유의성 있는 체중변화는 관찰되지 않았다. 또한 부검 시장기중량 및 상대중량을 측정한 결과, 대조군과 시험물질 투여군 간에 통계학적인 유의성을 관찰할 수 없었다(Table 5, 6)
- 본 연구는 2주 반복투여독성시험으로 진행되었으며, 택사가 비교적 안전한 물질인 것을 재차 확인할 수 있었다. 추가적으로 13주 반복 경구 투여 독성시험과 유전독성에 대한 연구들이 수행된다면, 한약재로써의 택사에 대한 안전성뿐만 아니라 점차로 확대되어 가는 한약 소재 시장에서 새로운 원료물질로써 관심을 받게 될 것으로 생각한다.
- 시험 전 기간 동안 대조군과 비교하여 시험물질 투여로 인한 유의성 있는 음수율 및 사료섭취량 변화는 관찰되지 않았다.
- 이는 택사가 전통적으로 비뇨생식기에 작용하는 약물임을 이해하는데 의미 있는 데이터로 간주할 수 있다. 혈액검사 영역에서도 유의성 있는 변화가 관찰되지는 않았으나, 혈액생화학적검사의 결과에서 특히 수컷 Rat의 AST가 대조군에 비하여 상당부분 증가하였다가 고용량에서 급격히 감소되는 경향을 보였다. 이러한 결과는 급성경구투여 독성시험에서도 나타났으며, 택사를 사용할 때 투여량에 따라 효능에 차이를 보일 가능성이 있다고 생각된다.
후속연구
- 특히 최근에는 택사가 가지고 있는 다양한 효능, 효과가 과학적으로 입증되고 새로운 효능이 발견되는 추세에 있어 더욱 관심의 대상이 되고 있다. 따라서 택사의 안전성에 대한 과학적 검증이 반드시 필요한 상황이며, 이를 토대로 택사의 다양한 활용분야를 개발할 수 있을 것으로 기대한다.
- 또한 한약은 오랜 기간 사용되어 왔기에 안전할 것이라는 인식으로 그 독성과 부작용에 대한 과학적인 근거가 확보되지 않아 국민 건강을 위협하는 요소로 작용하고 있다4). 따라서 한약소재에 대한 과학적 검증과 안전성을 확보함으로써, 국민건강에 대한 안전과 한약 시장의 장기적인 발전을 위한 토대를 마련할 수 있을 것이다5). 또한 한약재의 독성과 인체에 대한 자극에 대해서도 일정부분 해답을 제시할 수 있을 것으로 기대한다.
- 추가적으로 13주 반복 경구 투여 독성시험과 유전독성에 대한 연구들이 수행된다면, 한약재로써의 택사에 대한 안전성뿐만 아니라 점차로 확대되어 가는 한약 소재 시장에서 새로운 원료물질로써 관심을 받게 될 것으로 생각한다. 또한 택사에 대한 체계적인 독성정보를 구축하고, 보다 정확하고 과학적인 안전성 자료를 제공할 수 있을 것으로 기대한다.
- 따라서 한약소재에 대한 과학적 검증과 안전성을 확보함으로써, 국민건강에 대한 안전과 한약 시장의 장기적인 발전을 위한 토대를 마련할 수 있을 것이다5). 또한 한약재의 독성과 인체에 대한 자극에 대해서도 일정부분 해답을 제시할 수 있을 것으로 기대한다.
- 특히 주목할 사항은 암컷 Rat에서는 이 같은 변화가 관찰되지 않았다는 점이다. 이는 택사가 웅성개체에 대하여 특이적인 효능을 발휘할 수 있음을 시사하며, 이와 관련된 후속 연구가 추가적으로 수행된다면 택사에 대한 중요한 연구 자료를 추가할 수 있을 것으로 기대한다.
- 5g/ ㎏에서 유의성 있는 체중의 증가가 관찰되었으며, 암컷 Rat에서도 저농도에서의 체중증가가 두드러지게 나타났다. 이러한 결과는 택사의 약리작용이 농도에 따라 차이를 보일 수 있을 것으로 생각되며, 추가적인 연구가뒷받침 되어야 할 것으로 보인다. 또한 개별 장기의 중량변화에 있어서는 대조군과 비교하여 수컷 Rat의 고환무게가 저농도에서 유의성 있게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
- 본 연구는 2주 반복투여독성시험으로 진행되었으며, 택사가 비교적 안전한 물질인 것을 재차 확인할 수 있었다. 추가적으로 13주 반복 경구 투여 독성시험과 유전독성에 대한 연구들이 수행된다면, 한약재로써의 택사에 대한 안전성뿐만 아니라 점차로 확대되어 가는 한약 소재 시장에서 새로운 원료물질로써 관심을 받게 될 것으로 생각한다. 또한 택사에 대한 체계적인 독성정보를 구축하고, 보다 정확하고 과학적인 안전성 자료를 제공할 수 있을 것으로 기대한다.
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