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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 새로운 항결핵 치료물질 개발의 일환으로 환삼덩굴의 건조물을 이용하여 이를 여러 용매별로 추출물을 제조한 다음 이들 물질의 항결핵 효과를 조사해 보고자 하였다.
- 결핵균은 세포내에 기생하는 병원체로 알려져 있는데 체내에 침입 후 탐식구에 감염되어 질병을 일으키므로 탐식구의 역할이 매우 중요하다고 할 수 있다. 따라서 환삼덩굴 추출물이 탐식구에 감염된 결핵균에 대한 증식억제 작용이 있는지 알아보고자 하였다. 탐식구는 사람의 대식구 세포주인 THP-1 cell을 연세대학교 의과대학 미생물학교실에서 분양 받아 실험에 사용하였다.
- 본 연구에서는 지금까지 민간요법 상으로 또는 고전 한의학 서적 등에 결핵치료에 효과가 있다고 알려져 오던 환삼덩굴이 실제로 균 배양배지 내에서 결핵균에 직접 작용하여 살상 또는 균성장을 억제함을 최초로 보여주었다. 한가지 특이한 점은 환삼덩굴 추출물이 두 가지 방향에서 항결핵 작용을 보여 주었는데 첫번째는 결핵균에 대한 직접적인 효과이다.
- 환삼덩굴의 항결핵효능을 알아보기 위하여 두 가지의 실험을 실시하였다. 먼저 환삼덩굴의 메탄올 추출물을 만들어 결핵균에 직접 작용시켰을 때 아주 우수한 결핵균살상효과를 보였다.
가설 설정
- 2)Culture media without serum was used in this experiment.
제안 방법
- Formazan형성을 확인한 후, 배지를 완전히 제거하고, 100 μL의 DMSO를 첨가한 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- THP-1 세포주에 PMA 10 ng/mL을 처리 후, 2×104 cells/well로 맞추고 96 well plate에 각각 100 μL씩 첨가하여 72시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하여 대식구로 분화시킨 후, 환삼덩굴 추출물을 500 μg/mL의 농도부터 1/2씩 희석 제조하여 250, 125, 62.5, 0.2 μg/mL 의 농도로 처리하였다.
- 24 well plate에 대식구로 분화된 THP-1 세포주를 2×105 cells/well로 분주한 후 H37Rv 5 multiplicity of infection (MOI)로 감염을 시켰다. 결핵균 감염 1시간 전에 THP-1 cell에 환삼덩굴 추출물을 처리 하였으며, 감염 24시간 후에 탐식되지 않은 균주를 세척하고 이 후 6일 동안 배양기에서 배양하면서 1일, 3일, 6일에 탐식구를 회수하여 cytospin 슬라이드를 만들어 AFB 결핵균염색(Acid-Fast Bacilli) 및 세포염색(Giemsa)을 실시 한 후 광학 현미경을 통해 결핵균 증식 및 억제상태를 확인하였다. 환삼덩굴 메탄올추출물의 각 용매 분획물도 위와 같은 방법으로 활성을 측정하였다.
- 세포배양은 RPMI1640 medium 배지(Welgene, Daegu, Korea)에 10% fetal bovine serum (FBS, Welgene, Daegu, Korea)를 첨가하여 5% CO2 incubator 에서 배양하였다. 먼저 환삼덩굴 추출물의 세포독성을 측정하기 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다.
- 메탄올 추출액 50 mL을 농축하여 175 mg을 획득하여 7%의 회수율을 얻었다. 메탄올 추출물은 서로 극성을 달리하여 헥산, 클로르포름, 에틸 아세테이트, 부탄올, 물층으로 분획하여 각각의 용매 분획물을 얻었다.
- 1×105개의 H37Rv를 100 μL씩 각 well에 접종한다. 실험 plate를 37℃, 5% CO2 incubator에서 최소 3주간 배양하면서 inverted microscope를 통해 결핵균의 증식 상황을 관찰 측정하였다. 이 모든 실험은 3회 반복으로 이루어 졌으며 같은 결과를 얻었다.
- 추출물의 농도는 MTT reduction assay에서 얻은 125 μg/mL를 기준으로 15.6, 31.2, 62.5, 125, 250 mg/mL 농도로 처리하였다.
- 이 모든 실험은 3회 반복으로 이루어 졌으며 같은 결과를 얻었다. 환삼덩굴 메탄올 추출물의 각 용매 분획물도 같은 방법으로 항결핵균 활성을 측정하였다.
- 결핵균 감염 1시간 전에 THP-1 cell에 환삼덩굴 추출물을 처리 하였으며, 감염 24시간 후에 탐식되지 않은 균주를 세척하고 이 후 6일 동안 배양기에서 배양하면서 1일, 3일, 6일에 탐식구를 회수하여 cytospin 슬라이드를 만들어 AFB 결핵균염색(Acid-Fast Bacilli) 및 세포염색(Giemsa)을 실시 한 후 광학 현미경을 통해 결핵균 증식 및 억제상태를 확인하였다. 환삼덩굴 메탄올추출물의 각 용매 분획물도 위와 같은 방법으로 활성을 측정하였다.
- incubator에서 배양하여 환삼덩굴 추출물의 결핵균 증식억제 효과를 관찰하였다. 환삼덩굴 추출물의 농도는 위의 MTT reduction assay를 통해 독성이 없다고 인정된 농도를 사용하였다. 24 well plate에 대식구로 분화된 THP-1 세포주를 2×105 cells/well로 분주한 후 H37Rv 5 multiplicity of infection (MOI)로 감염을 시켰다.
- 환삼덩굴 추출물의 인체세포에 대해 독성 정도를 알아보기 위해 MTT reduction assay를 실시하였다. Fig.
- 환삼덩굴 추출물의 탐식구를 통한 항결핵활성을 확인하기 위해 THP-1 세포주에 환삼덩굴 추출물을 가한 후 결핵균을 감염시켜 6일 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하여 환삼덩굴 추출물의 결핵균 증식억제 효과를 관찰하였다. 환삼덩굴 추출물의 농도는 위의 MTT reduction assay를 통해 독성이 없다고 인정된 농도를 사용하였다.
- 환삼덩굴 추출물이 결핵균을 직접 죽이거나 증식을 억제하는 효능이 있는지 알아보기 위하여 배양배지 내에 결핵균과 추출물을 같이 넣어 배양해 보았다. 추출물의 농도는 MTT reduction assay에서 얻은 125 μg/mL를 기준으로 15.
- 환삼덩굴 추출물이 탐식구를 통한 항결핵 효능이 있는지 알아 보기 위해 사람의 대식구를 환삼덩굴 추출물과 같이 한 시간 가량 배양 한 후 대식구에 결핵균을 감염시켜 보았다.
- Table 3은 환삼덩굴 메탄올 추출물의 농도별 결핵균증식억제 효과를 나타내고 있는데 결핵균증식억제 효과는 추출물의 농도증가에 따른 상승 효과는 없었다. 환삼덩굴의 메탄올 추출물로부터 얻은 헥산, 클로르포름, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물의 분획 추출물을 가지고 같은 방법으로 항균활성을 확인하였다. 이 결과를 Table 4 및 Fig.
- 두번째로 탐식구에 감염된 결핵균에 대한 증식 억제효능이 있는지 알아 보기 위해 사람의 대식구에 메탄올 추출물을 작용시킨 후 결핵균을 감였시켰을 때 대조군에 비해 현저한 결핵균 증식억제 효과를 보였다. 환삼덩굴의 메탄올 추출물로부터 여러가지 용매를 통해 다섯 가지의 분획물을 얻어 같은 실험을 실시하였다. 이들 분획물 중 결핵균 직접 살상효과를 보인 것은 헥산과 에틸아세테이트층이었고, 탐식구에 감염된 결핵균에 대한 증식억제 효능을 보인 것은 부탄올과 물층이었다.
- Table 1은 항결핵균 살상효능을 환삼덩굴 메탄올 추출물 농도별로 활성도를 나타낸 것이다. 환삼덩굴의 메탄올 추출물을 다시 헥산, 클로르포름, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물 순으로 점차 극성을 높이면서 분획 추출하여 항결핵균활성을 확인하였다. 결과는 Table 2에서 보여 주고 있는데, 헥산층과 에틸아세테이트층에서 강력한 항결핵균 활성을 보였고, 나머지 용매층에서는 아무런 효과를 보이지 않았다.
대상 데이터
- 탐식구는 사람의 대식구 세포주인 THP-1 cell을 연세대학교 의과대학 미생물학교실에서 분양 받아 실험에 사용하였다. 세포배양은 RPMI1640 medium 배지(Welgene, Daegu, Korea)에 10% fetal bovine serum (FBS, Welgene, Daegu, Korea)를 첨가하여 5% CO2 incubator 에서 배양하였다. 먼저 환삼덩굴 추출물의 세포독성을 측정하기 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다.
- 환삼덩굴은 2011년 5월 충청북도 제천지역에서 채취하여 건조한 것으로 상온에서 보관하여 시료로 사용하였다. 시료 추출용 유기용매는 99% 이상의 1급 시약(Duksan Pure Chemicals Ltd., Ansan, Korea)으로 메탄올, 헥산, 클로르포름, 에틸 아세테이트, 부탄올 등을 사용하였다.
- 시험용 배지는 결핵균 배양배지인 Middlebrook 7H9에 10% bovine serum albumin (BSA)를 첨가한 것과 첨가하지 않은 것 두가지를 사용 하였다. 24 well plate에 위의 두가지 배양배지를 well 당 900 μL씩 분주 한 후, 메탄올 추출물을 첨가한다.
- 따라서 환삼덩굴 추출물이 탐식구에 감염된 결핵균에 대한 증식억제 작용이 있는지 알아보고자 하였다. 탐식구는 사람의 대식구 세포주인 THP-1 cell을 연세대학교 의과대학 미생물학교실에서 분양 받아 실험에 사용하였다. 세포배양은 RPMI1640 medium 배지(Welgene, Daegu, Korea)에 10% fetal bovine serum (FBS, Welgene, Daegu, Korea)를 첨가하여 5% CO2 incubator 에서 배양하였다.
- 항균실험에 사용한 결핵균주는 표준결핵균주로 알려진 H37Rv로 국제결핵연구소(Changwon, Korea)에서 보유하고 있는 것으로 사용하였다. 결핵균 배양은 Middlebrook 7H9 배지(Becton & Dickinson, Sparks, MD, USA)에 최소 3주간 배양하였다.
- 환삼덩굴은 2011년 5월 충청북도 제천지역에서 채취하여 건조한 것으로 상온에서 보관하여 시료로 사용하였다. 시료 추출용 유기용매는 99% 이상의 1급 시약(Duksan Pure Chemicals Ltd.
성능/효과
- Fig. 4는 결핵균에 감염된 THP-1 cell의 결과를 보여 주는데 결핵균 감염 후 6일이 지났을 때 환삼덩굴 추출물이 첨가되지 않은 군(Macrophage+H37Rv)에서는 결핵균(violet staining)이 많이 증식되어 있을 뿐 아니라 대식구도 많이 죽어 있었으며 살아 있는 세포들도 형태상으로 건강해 보이지 않고 있음을 알 수 있으나, 추출물이 첨가된 군(62.5, 125, 250 μg/mL)에서는 현저하게 결핵균의 증식이 억제되어 있고 세포들의 상태도 좋아 보였다.
- 결핵균 감염 후 6일이 지났을 때 결핵균에 감염된 군(Macrophage+H37Rv)에서는 결핵균이 많이 증식되어 있음을 알 수 있으나 부탄올 추출물이 첨가된 군(170, 340, 680 μg/mL)에서는 현저하게 결핵균의 증식이 억제되어 있음을 확인하였다.
- 이런 직접적인 효과는 현재 사용되고 있는 항생제를 포함한 대부분의 결핵약제에서 약효를 나타내는 방식이다. 두 번째로는 사람의 탐식구를 통해 탐식구에 감염되있는 결핵균의 성장 및 증식을 억제하는 효과를 보여주었다. 이 경우 정확한 작용기전을 알 순 없지만 두 가지 가능성을 제시해 볼 수 있는데 먼저, Fig.
- 먼저 환삼덩굴의 메탄올 추출물을 만들어 결핵균에 직접 작용시켰을 때 아주 우수한 결핵균살상효과를 보였다. 두번째로 탐식구에 감염된 결핵균에 대한 증식 억제효능이 있는지 알아 보기 위해 사람의 대식구에 메탄올 추출물을 작용시킨 후 결핵균을 감였시켰을 때 대조군에 비해 현저한 결핵균 증식억제 효과를 보였다. 환삼덩굴의 메탄올 추출물로부터 여러가지 용매를 통해 다섯 가지의 분획물을 얻어 같은 실험을 실시하였다.
- 환삼덩굴의 항결핵효능을 알아보기 위하여 두 가지의 실험을 실시하였다. 먼저 환삼덩굴의 메탄올 추출물을 만들어 결핵균에 직접 작용시켰을 때 아주 우수한 결핵균살상효과를 보였다. 두번째로 탐식구에 감염된 결핵균에 대한 증식 억제효능이 있는지 알아 보기 위해 사람의 대식구에 메탄올 추출물을 작용시킨 후 결핵균을 감였시켰을 때 대조군에 비해 현저한 결핵균 증식억제 효과를 보였다.
- 3은 실험 plate를 직접 현미경 하에서 사진 촬영한 것으로 배양배지에 혈청성분이 들어간 것(with BSA) 그리고 혈청성분이 들어가지 않은 것(w/o BSA)으로 위 아래로 각각 duplicate로 나누어 실험하였다. 사진에서 보듯이 추출물 성분이 들어가지 않은 control의 경우 결핵균 접종 3주 후에 두 가지 배지에서 모두 결핵균이 현저하게 자라 있었다. 환삼덩굴 메탄올 추출물을 농도별로 가했을때 31.
- 이와 같이 환삼덩굴의 메탄올 추출물에서 결핵균에 대한 증식 억제효과를 보임에 따라 다시 메탄올 추출물을 극성에 따라 여러가지 분획물로 분리 한 후 각각의 분획물에 대한 항결핵 효과를 보았을 때, 헥산과 에틸아세테이트 분획물에서는 직접적인 결핵균 살상효과가 있었고 반면 부탄올층과 물층에서만 탐식구를 통한 결핵균 증식억제활성을 보였다. 이것으로 볼 때 환삼덩굴 추출물은 한가지 성분이 아닌 두 가지 이상의 서로 다른 성분에서 서로 다른 작용기전을 통해 항결핵 효과를 나타내는 것이 아닌가 생각한다.
- Formazan형성을 확인한 후, 배지를 완전히 제거하고, 100 μL의 DMSO를 첨가한 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 환삼덩굴 추출물을 처리하지 않고 배양시킨 대조군 세포를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포생존율로 나타내었다.
후속연구
- 결론적으로 환삼덩굴은 결핵균에 대해 아주 우수한 살균 및 증식 억제 효능을 갖고 있으며 새로운 항결핵 치료제 개발에 대한 많은 가능성을 제시해 주는 식물이라 할 수 있으며 향 후 연구 가치가 매우 높다고 하겠다.
- 현재 결핵치료에 있어서 가장 큰 걸림돌이 되고 있는 다제내성결핵의 경우 주요 약제에 대한 내성이 문제가 되고 있는데(2) 만약 환삼덩굴이 탐식구 활성화에 의한 결핵균 억제기전이 있고 이에 따른 치료제가 나온다면 약제내성에 구애 받지 않아 결핵퇴치에 크게 기여 할 것으로 보인다. 따라서 이에 대한 후속 연구로 본 연구실에서는 환삼덩굴의 사람 탐식구에 대한 면역학적 작용기전 규명 실험이 진행 중에 있다.
- 한편, 환삼덩굴 추출물이 결핵균에 대해 직접적인 살균 효과를 보이긴 했으나 배양배지 내에 혈청성분이 있을 경우 그 효과가 사라졌다. 실제로 사람이나 동물의 체내에 혈청 성분이 있다는 점을 감안할 때 좀 더 많은 기초 연구가 진행 되어야 할 것으로 사료된다. 특히 유효 활성 성분에 대한 유기화학적 연구를 통해 혈청에 방해 받지 않는 구조로의 전환을 꾀한다면 체내에서도 충분한 항결핵균 효과를 얻을 수 있을 것으로 생각된다.
- 이들 분획물 중 결핵균 직접 살상효과를 보인 것은 헥산과 에틸아세테이트층이었고, 탐식구에 감염된 결핵균에 대한 증식억제 효능을 보인 것은 부탄올과 물층이었다. 이처럼 환삼덩굴은 결핵균에 대해 직접적인 살상효과 뿐 아니라 탐식구에 감염되어 있는 결핵균의 증식을 억제하는 효과도 보여 주었는데 이와 같은 결과로 볼 때 환삼덩굴로부터 새로운 결핵치료물질 개발을 기대해 볼 수 있을 것으로 기대된다.
- 이것으로 볼 때 환삼덩굴 추출물은 한가지 성분이 아닌 두 가지 이상의 서로 다른 성분에서 서로 다른 작용기전을 통해 항결핵 효과를 나타내는 것이 아닌가 생각한다. 최근 환삼덩굴로 부터 여러가지 성분을 분석한 연구결과가 여러 실험실에서 보고 되고 있는데(8,9) 항결핵 효능을 보인 분획물에서 각각의 최종 단일 성분 분리를 위한 계속적인 연구도 필요하다고 하겠다.
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