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문제 정의
- 따라서 본 연구는 고다치즈의 숙성기간 단축 및 풍미 향상을 위하여 1년 이상 숙성된 고다치즈에서 단백분해능이 우수한 유산균주를 screening 하여 L. rhamnosus_p1을 분리·동정하였으며, 이 균주를 이용하여 성형방법을 개선한 고다치즈를 제조하고, 숙성기간에 따른 품질변화를 측정하여 국내산 고다치즈의 풍미 향상을 위한 기초자료로 사용하고자 한다.
- 본 연구는 숙성기간 단축 및 최종 제품의 소비자 편의를 높이기 위한 방법으로 1년 이상 숙성된 고다치즈에서 단백분해능이 우수한 유산균주를 screening하여 단백분해능 및 내산성이 높은 L. rhamnosus_p1을 분리·동정하였으며, 이 균주를 이용한 고다치즈를 제조하여 숙성기간에 따른 품질 변화를 측정하였다.
제안 방법
- 1 N HCl를 사용하여 pH 2.5로 조정한 MRS broth(Lacto- bacilli MRS broth, Difco, USA)를 사용하여 내산성을 측정하였다. 분리된 유산균을 MRS broth에서 37℃로 24시간 배양한 후 4,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 상등액을 버리고 균을 회수하였다.
- AOAC법에 따라서 수분, 단백질, 지방과 회분 함량을 측정하였으며, 1개월 간격으로 총 5개월 동안의 변화를 측정하였다(AOAC, 1990).
- , USA)을 수행하여 증폭시켰다. PCR 산물은 BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(Applied Biosystems, Belgium)를 이용하여 ABI Prism 3730XL analyzer(Applied Biosystems, Belgium)로 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 NCBI BLASTN 프로그램(http://blast.
- 분리된 유산균을 MRS broth에서 37℃로 24시간 배양한 후 4,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 상등액을 버리고 균을 회수하였다. pH 2.5로 조정한 MRS broth 10 mL에 회수한 균 1%를 접종하여, 37℃에서 2시간 배양한 후 생균수를 측정하였다.
- pH는 시료를 10 g 취하여 멸균생리식염수 20 mL로 균질화 시킨 다음, pH meter(UB-10, Denver Instrument Co., Ltd., USA)를 이용하여 1개월 간격으로 총 5개월 동안의 변화를 측정하였다.
- 고다치즈 제조를 위한 유산균주의 분리원은 1년 이상 숙성된 고다치즈를 사용하였으며, MRS agar를 이용하여 총 5종의 균주를 분리하였다(Table 2). 분리 유산균주는 이플 고다치즈에서 분리한 L.
- 고다치즈의 숙성 중 유산균수의 변화는 1개월 간격으로 시료를 채취하여 멸균식염수에 십진 희석법으로 희석한 뒤, BCP 한천배지를 이용하여 평판배양법으로 37℃에서 48시간 배양하였다. 그 후 나타난 노란색 colony 수를 측정하여 log CFU(colony forming unit)/mL로 나타내었다.
- 관능검사요원 15명을 대상으로 색(color), 향(flavor), 맛(taste), 조직감(texture) 및 전반적인 기호도(overall acceptability)를 5점 척도법으로 평가하도록 하였다.
- 균의 16S rRNA를 universal primer인 27F(5'-AG AGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-TACGGYTAC CTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하여 PCR(DNA engine tetrad 2 peltier thermal cycler, Bio-rad lab., USA)을 수행하여 증폭시켰다.
- 치즈 단백질의 대부분을 차지하는 casein을 가수분해 할 수 있는지 측정하기 위하여 nutrient agar 23 g과 skim milk 50 g을 증류수 100 mL에 녹인 후 멸균한 다음 plate에 20 mL로 분주 후 굳혔다. 그 후 분리된 유산균주를 백금이로도 말하여 균체주위에 투명환이 나타나는지 측정하였다.
- casei_p2가 이와 유사한 내산성을 나타내었다. 사람의 분비위액의 pH는 1~2 정도이지만 침과 음식의 섭취에 의해 희석되므로, 위에서의 L. rhamnosus_p1, p4 및 L. casei_p2이 균의 생존율은 크게 나쁘지 않은 것으로 추정되며, 본 연구에서는 casein의 분해효과가 높고 내산성이 우수한 L. rhamnosus_p1 균주를 우선적으로 선정하여 고다치즈 제조하였다.
- 선택된 유산균주 L. rhamnosus_p1, L. casei_p2, L. curvatus_ p3, L. rhamnosus_p4 및 S. saprophyticus_p5의 단백질 가수 분해능을 측정하기 위하여 각각의 균주는 1.0×108 CFU/mL로 조정하여 skim milk에 대한 가수분해능을 조사하였다(Table 3).
- 선택된 유산균주 L. rhamnosus_p1을 이용하여 Gouda cheese를 제조하였으며, 대조구는 상업적 균주 Flora Danica 50을 사용하여 숙성 중 이화학적 특성을 비교하였다. 숙성 초기대조구의 수분, 단백질, 지방 및 회분의 함량은 각각 43.
대상 데이터
- 유리아미노산의 정량 분석은 소요시간이 상대적으로 짧은 Waters AccQ-tag 방법을 이용하여 분석하였다. HPLC(Waters e2695, Waters Co., USA)의 분석조건은 Table 1과 같으며, 17종의 아미노산 표준품으로 aspatic acid(Asp), serine(Ser), glutamic acid(Glu), glycine(Gly), histidin(His), arginine(Arg), threonine(Thr), alanine(Ala), proline(Pro), cysteine(Cys), tyro- sine(Tyr), valine(Val), methionine(Met), lysine(Lys), isoleucine (Ile), leucine(Leu), phenylalanine(Phe)과 AccQ-Fluor reagen 및 Borate buffer는 Waters사 제품을 사용하였다.
- cremoris로 구성되어 있다. Starter 배양을 위한 배지로는 환원 탈지유(Seoul Milk Co., Ltd., Korea)를 10% 농도로 희석하여 사용하였다.
- 대조군은 Flora Danica 50 만을 starter로 사용하였고, 실험군은 Flora Danica 50을 이용하여 치즈를 만든 후 최종제품을 세절하고 분리균주를 1×108 CFU/mL 농도로 조정하여 분무기로 세절한 Gouda cheese 표면에 3초간 분사한 다음, 건조 후 질소치환 포장을 하여 14℃ 저온 저장고에서 5개월간 숙성하면서 1개월마다 시료를 채취하여 이화학분석시료로 사용하였다(Fig. 1).
- CFU/mL 이상으로 배양한 후 4℃로 냉장보관하며 사용하였다. 상업용 균주인 Flora Danica 50을 상기와 동일한 방법으로 배양하여 사용하였다. 대조군은 Flora Danica 50 만을 starter로 사용하였고, 실험군은 Flora Danica 50을 이용하여 치즈를 만든 후 최종제품을 세절하고 분리균주를 1×108 CFU/mL 농도로 조정하여 분무기로 세절한 Gouda cheese 표면에 3초간 분사한 다음, 건조 후 질소치환 포장을 하여 14℃ 저온 저장고에서 5개월간 숙성하면서 1개월마다 시료를 채취하여 이화학분석시료로 사용하였다(Fig.
- 유산균 분리를 위하여 1년 이상 숙성된 고다치즈는 이플영농조합법인(Imsil, Korea), 치즈가(Imsil, Korea) 및 Westlann kaasexport사(Zuiderzee, Holland)에서 제조된 시판제품을 구입하여 실험에 사용하였다. 고다치즈 제조에 사용된 원유는 임실지역 낙농가에서 착유하여 사용하였으며, 상업용 균주는 Chr.
- , Japan)에 획선평판법으로 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하여 노란색을 보이는 colony를 2차 분리하였다. 이플 올드 고다치즈 제품으로부터 2종, 치즈가 고다치즈 제품으로부터 2종, 올드 암스테르담 제품으로부터 1종이 분리되었으며, 이를 MRS agar에 접종하여 37℃에서 24~72시간 배양 후 4℃로 냉장 보관하면서 사용하였다.
데이터처리
- 1 cycle sequencing kit(Applied Biosystems, Belgium)를 이용하여 ABI Prism 3730XL analyzer(Applied Biosystems, Belgium)로 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 NCBI BLASTN 프로그램(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 사용하여 유산균을 동정하였다.
이론/모형
- 분리균은 16S rRNA 결정법으로 동정하였으며, 염기서열 분석회사인 (주)Macrogen(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 수행하였다. 균의 16S rRNA를 universal primer인 27F(5'-AG AGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-TACGGYTAC CTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하여 PCR(DNA engine tetrad 2 peltier thermal cycler, Bio-rad lab.
- 유리아미노산의 정량 분석은 소요시간이 상대적으로 짧은 Waters AccQ-tag 방법을 이용하여 분석하였다. HPLC(Waters e2695, Waters Co.
성능/효과
- rhamnosus_p1을 분리·동정하였으며, 이 균주를 이용한 고다치즈를 제조하여 숙성기간에 따른 품질 변화를 측정하였다. 1년 숙성된 고다치즈 3개 제품에서 분리해낸 유산균주는 총 5종이며, 16S rDNA의 염기서열을 표준 균주와 비교하여 작성한 계통수 결과, L. rhamnosus 2종, L. casei, L. curvatus 및 S. saprophyticus로 판명되었고, 이 중 단백분해능과 내산성이 높은 L. rhamnosus_p1을 우선적으로 선정하여 절단형 고다치즈 제조 후 질소포장하여 숙성기간 중 이화학적 변화 및 아미노산 변화를 측정하였다. 숙성기간에 따른 수분, 단백질, 지방 및 회분의 변화는 대조구의 경우, 숙성기간이 증가할수록 수분함량이 감소하여 이에 따른 지방, 단백질 및 회분의 함량이 증가하였고, L.
- Gouda cheese의 숙성 중 맛, 향기, 조직감 및 전체적인 기호도를 5점 척도법으로 실시하였으며, 대조구는 각각 4.2, 4.0, 4.6 및 4.3로, L. rhamnosus_p1을 첨가한 실험구는 각각 4.8, 4.6, 4.8 및 4.7로 나타났다(Table 8). 관능검사 결과, 대조구에 비해 맛, 향기, 조직감 및 전체적인 기호도는 우수한 것으로 보이며, 고다치즈의 향기성분은 지방 분해, 단백질 분해 및 유당의 대사물 등에 의해 영향을 받으며, Alewijn 등(2005)은 지방 유래의 향기성분 물질인 ketones보다는단백질 유래 대사산물에 의해서 영향을 받는다고 하였고, 특히 Mariley와 Casey(2004)은 황함유 아미노산에 의해서 풍미가 증가된다고 보고하였다.
- , 2002; Yvon and Rijnen, 2001), 본 연구에 있어서도 glutamic acid, leucine 및 phenyl- alanine이 아미노산의 주요 성분으로 나타났다. L. rhamnosus_ p1을 첨가한 실험구는 대조구에 비해 숙성 초기에는 유리아미노산의 총 함량은 차이가 없다가 숙성 3개월째부터 증가하기 시작하였으며, 이로 인해 L. rhamnosus_p1을 첨가한 실험구의 pH는 숙성 3개월째 증가하는 것으로 보여진다.
- saprophyticus_p5 각각 77, 71 및 35%로 나타났다. S. saprophyticus_p5를 제외하고, 모두 70%이상의 내산성을 확인하였다. You 등(2005)은 kefir에서 분리한 L.
- rhamnosus_p1을 처리한 실험구는 숙성기간에 따른 일반성 분 함량의 변화 없는 것으로 나타났다. 대조구 및 L. rhamnosus_ p1을 첨가한 실험구의 유리아미노산의 함량은 숙성 초기 각각 16.63 및 16.01 mg/100 g에서 숙성기간이 증가함에 따라 숙성 3개월째 각각 40.80 및 54.70 mg/100 g 증가하였고, 숙성 5개월째에 71.55 및 77.12 mg/100 g으로 증가하였다. 주요 유리아미노산으로는 glutamic acid, leucine 및 phenylalanine으로 대조구는 각각 14.
- Gouda cheese의 숙성 중 유리아미노산의 변화를 Table 6 및 Table 7에 나타내었다. 대조구 및 L. rhamnosus_p1을 첨가한 실험구의 유리아미노산의 총 함량은 숙성 초기 각각 16.63 및 16.01 mg/100 g에서 숙성기간이 증가함에 따라 숙성 3개월째 각각 40.80 및 54.70 mg/100 g으로 증가하였고, 숙성 5개월째에 71.55 및 77.12 mg/100 g으로 증가하였다. 주요 유리아미노산으로는 glutamin acid, leucine 및 phenylalanine으로 대조구는 각각 14.
- 3에 나타내었다. 대조구는 숙성 초기 5.30에서 숙성 3개월째 5.20으로 감소하였다가 그 후 숙성기간 동안 증가하여 5.52까지 증가하였고, L. rhamnosus_p1을 처리한 실험구는 숙성 초기 5.29에서 숙성 2개월까지 약간 감소하여 5.22였다가 숙성 3개월째부터 증가하여 숙성 5개월째에 5.61까지 증가하였다. Lee와 Nam(1996)은 숙성 초기 curd 내에 잔존하는 lactose 분해에 따른 lactic acid의 생성으로 인해 pH가 감소하고, 그 후 pH의 상승은 단백질 분해와 암모니아 생성에 따른 상승이라 보고하였다.
- 또한 cheese 내 pH의 증가 이유를 lactic acid의 분해, 비활성 성분, 치환물의 생성, acetic acid, carbonic acid 와 같은 약하거나 완전 해리되지 않은 산의 생성 등과 단백질 분해에 의한 알칼리 물질의 유리 등이라고 보고한 연구도 있다(Visser and De Groat-Mastert, 1977; Visser, 1977). 본 연구에 있어서도 L. rhamnosus_p1을 첨가한 실험구는 대조구에 비해 1개월 빠르게 pH가 증가하였으며, L. rhamnosus_ p1 첨가에 따른 유리아미노산이 증가하여 숙성 후반의 pH증가한 것으로 생각된다.
- 고다치즈 제조를 위한 유산균주의 분리원은 1년 이상 숙성된 고다치즈를 사용하였으며, MRS agar를 이용하여 총 5종의 균주를 분리하였다(Table 2). 분리 유산균주는 이플 고다치즈에서 분리한 L. rhamnosus, L. casei 2종과 치즈가 고다치즈에서 분리한 L. curvatus, L. rhamnosus 2종, 올드암스테르담에서 분리한 S. saprophyticus 1종이 분리되었으며, 16s rDNA의 염기서열을 표준 균주와 비교하여 작성한 계통수 결과, 각각의 균주는 표준균주와 모두 98% 이상 일치하였고, 각각 L. rhamnosus_p1, L. casei_p2, L. curvatus_ p3, L. rhamnosus_p4 및 S. saprophyticus_p5로 명명하였다.
- 0×108 CFU/mL로 조정하여 skim milk에 대한 가수분해능을 조사하였다(Table 3). 선택된 유산균주 L. rhamnosus_p1, L. casei_p2, L. curvatus_p3, L. rhamnosus_p4 및 S. saprophyticus_p5 각각은 13, 8, 7, 9 및 0 mm의 투명환을 보였다. L.
- rhamnosus_p1을 이용하여 Gouda cheese를 제조하였으며, 대조구는 상업적 균주 Flora Danica 50을 사용하여 숙성 중 이화학적 특성을 비교하였다. 숙성 초기대조구의 수분, 단백질, 지방 및 회분의 함량은 각각 43.1, 20.1, 31.2 및 3.6%이었고, L. rhamnosus_p1을 처리한 실험구는 각각 44.2, 21.0, 30.9 및 3.5%로 측정되어 제조 직후의 일반성분 함량의 차이는 나타나지 않았다(Table 5). 숙성기간에 따른 수분, 단백질, 지방 및 회분의 변화는 대조구의 경우, 숙성기간 증가할수록 수분함량이 감소하였으며, 이에 따라 지방, 단백질 및 회분의 함량이 증가하였고, L.
- 5%로 측정되어 제조 직후의 일반성분 함량의 차이는 나타나지 않았다(Table 5). 숙성기간에 따른 수분, 단백질, 지방 및 회분의 변화는 대조구의 경우, 숙성기간 증가할수록 수분함량이 감소하였으며, 이에 따라 지방, 단백질 및 회분의 함량이 증가하였고, L. rhamnosus_p1을 처리한 실험구는 숙성기간에 따른 일반성분 함량의 변화가 없는 것으로 나타났다. Lee와 Nam(1996)은 Gouda cheese 숙성 중 일반성분은 수용성 plastic coating 처리시 숙성기간이 증가할수록 단백질, 지방 및 회분의 함량은 증가하는 반면, 수분의 함량은 감소한다고 하였고, 이는 수분의 감소에 따른 타 고형분의 상대적인 증가 때문이라고 보고하였으며, 진공포장의 경우는 수분 및 기타 고형분의 함량 변화는 없는 것으로 보고하여 본 연구에 있어서도 질소포장의 경우와 유사한 결과를 나타내었다(Fig.
- rhamnosus_p1을 우선적으로 선정하여 절단형 고다치즈 제조 후 질소포장하여 숙성기간 중 이화학적 변화 및 아미노산 변화를 측정하였다. 숙성기간에 따른 수분, 단백질, 지방 및 회분의 변화는 대조구의 경우, 숙성기간이 증가할수록 수분함량이 감소하여 이에 따른 지방, 단백질 및 회분의 함량이 증가하였고, L. rhamnosus_p1을 처리한 실험구는 숙성기간에 따른 일반성 분 함량의 변화 없는 것으로 나타났다. 대조구 및 L.
- , 1999). 유산균주의 내산성을 확인한 결과(Table 4), 생존율은 L. rhamnosus_ p1 및 p4가 82%로 가장 높았으며, 그 다음으로 L. casei_ p2, L. curvatus_p3 및 S. saprophyticus_p5 각각 77, 71 및 35%로 나타났다. S.
- 12 mg/100 g으로 증가하였다. 주요 유리아미노산으로는 glutamin acid, leucine 및 phenylalanine으로 대조구는 각각 14.32, 10.26 및 6.25 mg/100 g으로, L. casei_p2를 첨가한 실험구는 각각 16.33, 12.31 및 5.80 mg/100 g으로 나타났다. 유리아미노산은 starter bacteria 및 비의 도적 미생물에 의하여 단백질 분해 작용의 결과로 cheese 숙성이 진행되는 과정에서 cheese의 풍미에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있으며(Lee and Nam, 1996), cheese의 풍미에 영향을 주는 주요 아미노산으로 methionine, cysteine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, valine 및 leucine으로 보고 되어 있으며(Van Kranenburt et al.
후속연구
- 80 mg/100 g 나타났다. 관능검사 결과, 맛, 향기, 조직감 및 전체적인 기호도에 있어서 대조구보다는 L. rhamnosus_p1을 첨가한 실험구가 우수한 것으로 보이며, 향후 복합균주에 대한 연구가 추가적으로 진행된다면 Gouda cheese 제조를 위한 스타터로서의 이용 가능성이 높을 것으로 판단된다.
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