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문제 정의
- , 1991). 이러한 점을 착안하여 이번 연구에서는 DHA를 다량 함유하는 해양미생물(Thraustochytrid 科)을 분리 동정하여 DHA의 새로운 공급원으로서 이용하고자 한다.
제안 방법
- 첫째, 부유생물 시료는 3 µm 플랑크톤네트를 이용하여 해수를 여과 시킨 여과잔여물을 이용하였고, 둘째, 저질층 시료는 유기퇴적물이 비교적 풍부한 곳을 선정하여 직접 채니하였다.
- 유용미생물은 평판배지에 형성된 집락(colony)을 현미경을 이용하여 Thraustochytrid 과(科)와 유사형태를 가진 해양미생물을 선발하였다. 선발된 균체의 배양은 glucose 10 g/L, yeast extract 1.0 g/L 그리고 peptone 1.0 g/L 를 주요 성분으로 하는 GYEP배지를 부분적으로 보완하여(Table 1) pH 6.5로 조정된 평판배지에서 25℃에서 72시간 배양한 후, 이들 균주를 동일한 액상배지로 25℃, 120 rpm의 진탕배양기(KSI-200L, KOENCON)에서 72시간 배양하였다. 균체의 지방산 분석 시료는 균체 배양액을 원심분리기(HA-1000-3, Hanil science Industrial Co.
- 다음날 chloroform 층만을 분리하기 위하여 둥근 플라스크 위에 깔때기를 놓고, 여과지를 깔아 그 위에 Na2SO4를 넣어 서서히 chloroform층만 흘러내리게 하였다. 분리된 chloroform 층은 진공회전농축기(Rotavapor R-114, BUCHI)를 사용하여 40℃이하에서 용매를 완전히 증발시킨 후, 추출된 총 지질의 무게를 측정하였다. 모든 작업은 질소 기류 하에서 행하였다.
- 즉시 3 mL의 포화식염수를 가한 다음 흔들어 방치하여 iso-octane층이 분리되도록 하였다. isooctane층을 시료 병에 옮긴 후, 다시 iso-octane 1 mL 첨가한 다음 흔들어 재추출하여 시료 병에 모으고 이를 지방산 methylester 시료로 하였다.
- 이 때 주입기는 250℃, 검출기는 270℃ 그리고 carrier gas는 헬륨(He)을 사용하였다. 지방산의 분석은 동일조건에서 분석한 표준품의 ECL과 비교하여 동정하였고, 지방산 표준품은 14:0, 16:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 22:1, 24:0(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)과 GC-MS로 동정된 menhaden oil을 사용하였다.
- 분리된 해양미생물의 18S ribosomal DNA sequencing은 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용해 chromosomal DNA를 분리한 후, 18S rRNA sequencing에 사용하는 universal primer인 NS1 (5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')와 NS8 (5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3') primer를 사용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 전기영동장치(Wizard SV Gel)와 PCR clean-up system(Promega, USA)을 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystem, Foster, CA, USA)를 이용하여 염기서열을 분석하였다.
- 유용미생물의 분리는 Table 1에 나타낸 바와 같이 yeast extract (Becton, Dickinson and Company sperks, MD, USA) 1.0 g/L, peptone (Acumedia Manufacturers, Inc. Lansing, MI, USA) 1.0 g/L를 주요 성분으로 하는YEP 배지를 사용하였으며(Wong et al., 2005), 이 때 세균의 증식억제를 위해 penicillin-G (P3032, Sigma, USA)와 streptomycin sulfate (S-9137, Sigma, USA)를 각각 300 mg씩 별도로 멸균 처리된 증류수에 용해시켜 0.22 µm 여과지(Millipore)로 여과하여 분리용 평판 배지에 첨가하였다.
- 분리된 해양미생물의 18S ribosomal DNA sequencing은 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용해 chromosomal DNA를 분리한 후, 18S rRNA sequencing에 사용하는 universal primer인 NS1 (5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')와 NS8 (5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3') primer를 사용하여 PCR 증폭하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 전기영동장치(Wizard SV Gel)와 PCR clean-up system(Promega, USA)을 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystem, Foster, CA, USA)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 NCBI의 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 ribosomal DNA sequence와 비교하였으며, sequence의 상동 성은 Clustal X와 Mega 2 program을 이용하여 비교 분석하였다(Thompson et al.
대상 데이터
- DHA를 다량 함유하는 해양미생물의 분리를 위한 시료는 2006년 4월부터 10월까지 경상남도 통영, 고성 및 거제 일대 해안으로부터 3가지 방법으로 시료를 채취하였다(Fig. 1). 첫째, 부유생물 시료는 3 µm 플랑크톤네트를 이용하여 해수를 여과 시킨 여과잔여물을 이용하였고, 둘째, 저질층 시료는 유기퇴적물이 비교적 풍부한 곳을 선정하여 직접 채니하였다.
- 첫째, 부유생물 시료는 3 µm 플랑크톤네트를 이용하여 해수를 여과 시킨 여과잔여물을 이용하였고, 둘째, 저질층 시료는 유기퇴적물이 비교적 풍부한 곳을 선정하여 직접 채니하였다. 셋째, 조류(algae)는 해안가 연안에 부유성 조류를 시료로 채집하였다. 채취한 각각의 시료는 10℃ 로 유지되는 Ice Box에 넣어서 실험실로 운반하여 사용하였다.
- 65%로 높게 나타났다. 해안가 부유하는 조류에서 채취한 시료는 C-1, C-4, C-5, C-6, C-8, C-9, C-11, C-12, C-13, C-14, C-16 그리고 C-17 지점에서 12개의 균주를 분리하였으며 DHA는 각각 33.60, 16.77, 20.55, 49.41, 10.23, 19.88, 15.75, 24. 59, 10.
- 54%로 나타났다. 분리된 균주 23종 중에서 DHA 함량이 30% 이상인 B-10, B-12, C-1, C-6 그리고 C-16지점에서 분리한 균주 5종을 1차 선발하였다(Table 2).
데이터처리
- 모든 자료는 SPSS (12.0) 프로그램을 이용하여 분산분석(one-way ANOVA)을 실시하여 Duncan's multiple range test(Duncan, 1955)로 평균간의 유의성(P<0.05)을 검정하였다.
- 정제된 PCR 산물은 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystem, Foster, CA, USA)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 NCBI의 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 ribosomal DNA sequence와 비교하였으며, sequence의 상동 성은 Clustal X와 Mega 2 program을 이용하여 비교 분석하였다(Thompson et al., 1994).
이론/모형
- 지질 추출은 Bligh and Dyer (1959) 방법에 준하였다. 균체 중의 지질 추출 시료를 비커에 5 g 취하여 세포분쇄기(Homogenizer AM-12, Nihonseiki Kaisha Ltd.
성능/효과
- DHA생산량은 B-10, B-12, C-1, C-6 그리고 C-16지점에서 분리된 균주에서 각각 1.31, 1.93, 1.05, 1.63 그리고 1.50 g/L로 B-12지점에서 분리한 균주가 1.93 g/L로서 DHA 생산량이 가장 많이 하는 것으로 나타났으며(P<0.05), 다음으로 C-6지점에서 분리한 균주가 1.63 g/L로 많은 것으로 나타났다(P<0.05).
- 분리 선발된 균주 5종의 총 지질 함량에 관한 결과는 Table 2에 나타낸 바와 같이 B-10, B-12, C-1, C-6 그리고 C-16지점에서 분리된 균주에 따른 biomass는 각각 9.12, 9.36, 8.68, 8.92 그리고 9.08 g/L로 B-12지점에서 분리된 균주가 9.36 g/L로 가장 높게 나타났으며(P<0.05), total lipid는 각각 40.24, 43.79, 35.87, 37.02 그리고 38.91%로 B-12지점에서 분리된 균주가 43.79 %로 가장 높게 나타났다(P<0.05).
- 59, 10.26, 17.60, 42.54 그리고 20.33%로 C-6 지점에서 분리한 균주가 49.41%로 가장 높게 나타났으며(P<0.05), C-1 과 C-16지점에서 분리한 균주도 33.60%와 42.54%로 나타났다.
- 유기퇴적물에서 채취한 시료는 B-1, B-2, B-5, B-7, B-9, B-10, B-12, B-15 그리고 B-17지점에서 9개의 균주를 분리하였으며 DHA는 각각 26.40, 15.75, 24.59, 12.26, 11.85, 35.65, 47.01, 23.53 그리고 14.14% 로 B-12지점에서 분리한 균주의 DHA가 47.01%로 가장 높게 나타났으며(P<0.05), B-10지점에서 분리한 균주도 35.65%로 높게 나타났다.
- Thraustochytrid 科로 추정되는 해양미생물은 Fig. 2에서 보는 바와 같이 여과해수 잔여물에서 2종, 유기퇴적물에서 9종 그리고 조류에서 12종으로 총 23종을 분리하였다. 여과해수 잔여물에서는 A-2, A-12 지점에서 2개의 균주를 분리하였으며 DHA는 각각 18.
- 2에서 보는 바와 같이 여과해수 잔여물에서 2종, 유기퇴적물에서 9종 그리고 조류에서 12종으로 총 23종을 분리하였다. 여과해수 잔여물에서는 A-2, A-12 지점에서 2개의 균주를 분리하였으며 DHA는 각각 18.64% 와 12.75%로 나타났다. 유기퇴적물에서 채취한 시료는 B-1, B-2, B-5, B-7, B-9, B-10, B-12, B-15 그리고 B-17지점에서 9개의 균주를 분리하였으며 DHA는 각각 26.
- 선발된 균주 5종의 지방산 조성 분석 결과는 Table 3에 나타낸 바와 같이 B-10, B-12, C-1, C-6 그리고 C-16 지점에서 분리된 5종의 해양미생물의 DHA는 각각 35.65, 47.01, 33.60, 49.41 그리고 42.54%로 C-6 지점에서 분리한 균주가 49.41%로 가장 높게 나타났으며(P<0.05), 다음으로 B-12지점에서 분리된 균주가 47.01% 높게 나타났다(P<0.05).
- 05). 오메가-6 계열은 B-10, B-12, C-1, C-6 그리고 C-16 지점에서 분리한 균주가 각각 6.61, 13.65, 0.07, 0.00 그리고 13.41%로 C-6지점에서 분리한 균주에서 오메가-6 계열 지방산이 전혀 나타나지 않아 DHA 만을 추출하기에는 C-6지점에서 분리한 균주가 가장 적합한 것으로 나타났다. 이로서 23여종의 분리한 균주 중에 B-12와 C-6 지점에서 분리한 균주 2종이 DHA 생산 균주로서 적합한 것으로 나타났다(Fig.
- 41%로 C-6지점에서 분리한 균주에서 오메가-6 계열 지방산이 전혀 나타나지 않아 DHA 만을 추출하기에는 C-6지점에서 분리한 균주가 가장 적합한 것으로 나타났다. 이로서 23여종의 분리한 균주 중에 B-12와 C-6 지점에서 분리한 균주 2종이 DHA 생산 균주로서 적합한 것으로 나타났다(Fig. 3).
- 3, 4에 나타난 바와 같다. B-12지점에서 분리된 균주는 Schizochytrium mangrovei 로 동정되었으며(Fig. 3), C-6지점에서 분리된 균주는 Crypthecodium cohnii 로 동정되었다(Fig. 4).
후속연구
- , 1998). 따라서 해양미생물의 종에 따른 고도불포화지방산 생성 능력이 우수한 종을 찾아내는 것도 중요하지만, 배양 환경에 따른 물리적인 조건과 영양성분에 따른 생리적인 조건을 적절하게 조절하는 것이 무엇보다 중요하며 이러한 점을 고려하여 더 많은 연구가 이루어진다면 더욱 우수한 양질의 지질과 보다 많은 양의 DHA를 생산할 수 있을 것으로 사료된다.
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