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• 연구 주제
• 연구 방법
• 연구 결과

문제 정의

• 여러 환경인자 중 어떤 인자가 생산성에 가장 큰 영향을 미치는가에 대한 명확한 연구결과는 아직 보고되어 있지 않다(Singh and Ward, 1996). 따라서 이번 연구에서는 DHA의 대체 공급원으로서 Schizochytrium mangrovei (KCTC 11117BP)를 이용하여 배양조건과 영양조건에 따른 DHA 생산성 변화를 알아보고자 한다.

제안 방법

• 배양조건은 배양온도, 염분농도, pH, 교반속도와 배양시간을 각각 달리하여 실험하였다. 배양온도에 따른 실험은 진탕배양기(KSI-200L, Koencon Co.
• 배양조건은 배양온도, 염분농도, pH, 교반속도와 배양시간을 각각 달리하여 실험하였다. 배양온도에 따른 실험은 진탕배양기(KSI-200L, Koencon Co., Ltd)를 이용하여 15, 20, 24, 28, 32, 그리고 36℃로 실시하였으며, 염분농도에 따른 실험은 Sea salts (S9883, Sigma Chemical Co., St, Louis, USA)를 이용하여 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu로 실시하였다. pH에 따른 실험은 0.
• , St, Louis, USA)를 이용하여 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu로 실시하였다. pH에 따른 실험은 0.1 N HCl과 0.1 N NaOH를 이용하여 pH 5, 6, 7, 8 그리고 9로 실험을 실시하였으며, 교반속도에 따른 실험은 50, 100, 150 그리고 200 rpm로 실시하였다. 배양시간에 따른 실험은 접종 후, 24 시간마다 균체를 회수 측정하였다.
• 1 N NaOH를 이용하여 pH 5, 6, 7, 8 그리고 9로 실험을 실시하였으며, 교반속도에 따른 실험은 50, 100, 150 그리고 200 rpm로 실시하였다. 배양시간에 따른 실험은 접종 후, 24 시간마다 균체를 회수 측정하였다.

• 영양조건에 따른 영향

  영양조건에 따른 실험은 탄소원의 종류, 질소원의 종류 그리고 C/N 비율에 따른 실험을 실시하였다. 탄소원에 따른 성장은 GYEP배지(Table 1)에서 탄소원을 제외한 나머지 배지 조성에서 탄소원으로 Glucose, Fructose, Lactose, Maltose, Sucrose, Starch, 그리고 Glycerol 을 사용하였으며 실험은 25℃에서 72시간 각각 배양한 후, 소모된 탄소원의 양을 조사하여 영양 요구성을 결정하고, 균체수율, 지질함량과 DHA함량 변화를 알아보고자 하였다.

• 영양조건에 따른 실험은 탄소원의 종류, 질소원의 종류 그리고 C/N 비율에 따른 실험을 실시하였다. 탄소원에 따른 성장은 GYEP배지(Table 1)에서 탄소원을 제외한 나머지 배지 조성에서 탄소원으로 Glucose, Fructose, Lactose, Maltose, Sucrose, Starch, 그리고 Glycerol 을 사용하였으며 실험은 25℃에서 72시간 각각 배양한 후, 소모된 탄소원의 양을 조사하여 영양 요구성을 결정하고, 균체수율, 지질함량과 DHA함량 변화를 알아보고자 하였다. 균체수율과 탄소원의 잔류농도 측정은 시료 채취후, 즉시 시료가 담긴 시험관을 원심분리기(HA1000, HANIL, KOREA)를 통해 5,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 상층 액은 잔류 탄소원의 측정에 사용하였으며, 침전물은 균체량 수율, 지질함량 및 지방산분석에 사용하였다.
• 탄소원에 따른 성장은 GYEP배지(Table 1)에서 탄소원을 제외한 나머지 배지 조성에서 탄소원으로 Glucose, Fructose, Lactose, Maltose, Sucrose, Starch, 그리고 Glycerol 을 사용하였으며 실험은 25℃에서 72시간 각각 배양한 후, 소모된 탄소원의 양을 조사하여 영양 요구성을 결정하고, 균체수율, 지질함량과 DHA함량 변화를 알아보고자 하였다. 균체수율과 탄소원의 잔류농도 측정은 시료 채취후, 즉시 시료가 담긴 시험관을 원심분리기(HA1000, HANIL, KOREA)를 통해 5,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 상층 액은 잔류 탄소원의 측정에 사용하였으며, 침전물은 균체량 수율, 지질함량 및 지방산분석에 사용하였다. 탄소원의 소모량 측정은 YSI 2700 SELECT (Biochemistry Analyzer YSI 2700 SELECT^TM, YSI Co.
• 질소원에 따른 성장은 GYEP배지(Table 1)에서 질소원을 제외한 조성에서 질소원으로 Tryptone, Peptone, Yeast extract, Urea, Monosodium glutamate, Sodium nitrate 그리고 Ammonium chloride를 이용하여 이들을 각각 0.1% (w/v) 첨가하여 25℃에서 72시간 배양한 후, 균체량 수율, 지질함량과 DHA함량 변화를 측정하였다.
• C/N 비율에 따른 실험은 탄소원으로 glucose와 질소원으로 yeast extract를 이용하였다. 질소원인 yeast extract 1 g/L으로 고정시키고, 탄소원인 glucose 농도를 변화시키며 C/N 비율이 1, 5, 10, 15, 20 그리고 25 비율로 조정하였으며 실험은 25℃에서 72시간 각각 배양한 후, 균체량 수율, 지질함량과 DHA함량 변화를 측정하였다.
• , Tokyo, Japan)에서 15,000 rpm로 5분간 분쇄한 후, Chloroform과 Methanol을 2:1로 혼합한 추출 용매를 시료의 2배량 넣어 하루 동안 방치한 다음 chloroform 층만을 분리하기 위하여 둥근 플라스크 위에 깔때기를 놓고, 그 위에 Na₂SO₄를 넣어 서서히 chloroform층만 흘러내리게 하였다. 분리된 chloroform 층은 진공회전농축기(Rotavapor R-114, BUCHI)를 사용하여 40℃이하에서 용매를 완전히 증발시킨 후, 추출된 총 지질의 무게를 측정하였다. 모든 작업은 질소 기류 하에서 행하였다.
• 즉시 3mL의 포화식염수를 가한 다음 흔들어 방치하여 iso-octane층이 분리되도록 하였다. Iso-octane층을 시료 병(4 mL)에 옮긴후, 다시 Iso-octane 1 mL를 첨가한 다음 흔들어 재추출하여 시료 병에 모으고 이를 지방산 methyl ester 시료로 하였다.
• 0 kg/cm²)을 사용하였다. 지방산의 분석은 동일조건에서 분석한 표준품의 ECL과 비교하여 동정하였고, 지방산 표준품은 14:0, 16:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 22:1, 24:0(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)과 GC-MS로 동정된 menhaden oil을 사용하였다.
• 배양시간에 따른 균체량 수율, 지질함량 및 DHA함량은 접종 후 24, 48, 72, 96, 120 그리고 144시간 동안 배양하여 측정하였다. 균체량은 접종 후 24, 48 그리고 72 시간동안 배양하였을 때 각각 2.
• 질소원에 의한 영향으로는 Tryptone, Peptone, Yeast extract, Urea, Monosodium glutamate, Sodium nitrate 그리고 Ammonium chloride를 이용하여 각각 배양한 후 균체량 수율, 지질함량과 DHA함량을 측정하였으며 그 결과는 Table 11에 나타내었다. 질소원에 따른 균체량은 yeast extract구에서 8.

대상 데이터

• 배지 조성은 Glucose 10 g, Yeast extract 1 g, Peptone 1 g, H3BO3 4.09 mg, MnCl2 2.59 mg, ZnSO4·7H2O 0.31 mg, CuSO4 0.11 mg, NaMo4·2H2O 0.03 mg, CoSO4 0.03 mg, Sea salt20 g에 final volume 1 L, final pH 6.5로 조정하여 사용하였다.
• 본 연구에 사용된 균주는 Schizochytrium mangrovei (KCTC 11117BP)로 국립경상대학교 해양생물사료공학 연구실에서 직접 해양으로부터 분리한 균주를 사용하였다. 균주의 활성을 유지하기 위하여 일주일 간격으로 사면배지에 계대배양한 후 4℃에서 냉장보관하면서 접종용 균주배양에 사용하였다.
• 균주의 활성을 유지하기 위하여 일주일 간격으로 사면배지에 계대배양한 후 4℃에서 냉장보관하면서 접종용 균주배양에 사용하였다. 균주배양을 위한 배지는 GYEP medium (Wong et al., 2005)을 사용 하였다(Table 1). 배지 조성은 Glucose 10 g, Yeast extract 1 g, Peptone 1 g, H₃BO₃ 4.
• C/N 비율에 따른 실험은 탄소원으로 glucose와 질소원으로 yeast extract를 이용하였다. 질소원인 yeast extract 1 g/L으로 고정시키고, 탄소원인 glucose 농도를 변화시키며 C/N 비율이 1, 5, 10, 15, 20 그리고 25 비율로 조정하였으며 실험은 25℃에서 72시간 각각 배양한 후, 균체량 수율, 지질함량과 DHA함량 변화를 측정하였다.

데이터처리

• 모든 자료는 SPSS (12.0) 프로그램을 이용하여 분산분석(one-way ANOVA)과 회귀분석(Regression Analysis)을 실시하여 Duncan's multiple range test (Duncan, 1955)로 평균간의 유의성(P<0.05)을 검정하였다.

이론/모형

• 균체수율과 탄소원의 잔류농도 측정은 시료 채취후, 즉시 시료가 담긴 시험관을 원심분리기(HA1000, HANIL, KOREA)를 통해 5,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 상층 액은 잔류 탄소원의 측정에 사용하였으며, 침전물은 균체량 수율, 지질함량 및 지방산분석에 사용하였다. 탄소원의 소모량 측정은 YSI 2700 SELECT (Biochemistry Analyzer YSI 2700 SELECT^TM, YSI Co., USA)를 이용하였다.
• 총 지질 추출은 Bligh and Dyer (1959)에 준하였다. 비커에 균체 5 g 을 취하여 세포분쇄기(homogenizer AM-12, Nihonseiki Kaisha Co.

성능/효과

• 배양온도에 따른 지방산조성은 Table 3에 나타낸 바와 같이 배양온도가 높음에 따라 포화지방산의 비율이 현저히 증가되었고(P<0.05), 불포화지방산의 비율은 감소되었다(P<0.05).
• 또한 이때의 지질함량은 각각 46.24, 42.79, 36.87, 32.02, 30.91 그리고 28.58%로 배양온도가 높아짐에 따라 지질함량이 줄어들었으며(P<0.05), DHA함량도 각각 50.11, 48.84, 45.76, 44.31, 38.90 그리고 34.87%로 배양온도가 높아짐에 따라 줄어드는 것으로 나타났다(P<0.05).
• 배양온도 15, 20, 24, 28, 32 그리고 36℃에서 배양한 결과는 Table 2에 나타낸 바와 같이 배양온도에 따른 균체량 수율은 각각 2.23, 5.45, 9.06, 10.50, 9.80 그리고 4.06 g/L로 28℃에서 10.50 g/L로 가장 높은 균체수율을 가졌다(P<0.05).
• 05). 이상의 결과에서 성장은 28℃에서 가장 높게 나타났지만 지질과 DHA 함량의 경우는 낮은 온도일수록 높게 나타남에 따라 DHA의 생산에 가장 적합한 배양온도는 24℃와 28℃로 나타났다. 이전에 보고된 Thraustochytrids 과의 종에 따른 적정 배양 온도는 다양하게 나타났는데 Thrausochytrium antarcticum, T.
• 온도가 낮으면 불포화 지방산의 양이 많아지는 반면 배양 온도가 높으면 포화지방산의 양이 많아진다고 보고되고 있다(Neidelman, 1987). 이번 연구에서도 온도가 높아짐에 따라 포화지방산의 비율이 높아지는 것과 일치하는 것으로 나타났다.
• 또한 DHA생산량은 염분농도 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu에서 각각 1.16, 1.91, 1.72, 1.43 그리고 0.71 g/L로 20 psu구에서 1.91 g/L 로 가장 높게 나타났으며(P<0.05), DHA함량은 각각 45.70, 45.30, 44.90, 45.10 그리고 44.90%로 염분농도에 따른 차이는 보이지 않았다(P<0.05).
• pH 에 따른 지방산조성은 Table 7에 나타낸 바와 같이 pH 5, 6, 7, 8 그리고 9에서 배양한 결과 DHA함량은 각각 44.10, 46.73, 47.31, 44.77 그리고 42.14% 로서 pH 6과 pH 7에서 가장 높게 나타났다(P<0.05).
• 또한 DHA함량은 각각 1.45, 1.90, 2.13, 1.55 그리고 1.27 g/L로 나타나 pH 7에서 가장 높게 나타났다(P<0.05).
• 지질함량은 각각 35.47, 39.17, 41.88, 35.34 그리고 33.89%로 pH 7에서 가장 높게 나타났다 (P<0.05).
• 05). 이상의 결과로 DHA생산에 따른 가장 적합한 염분 농도는 20 psu로 나타났다. 이전에 보고된 Thraustochytrids과의 종에 따른 적정 염분농도는 다양하게 나타났는데 T.
• 교반속도에 따른 균체량 수율은 교반 속도 50, 100, 150그리고 200 rpm에서 각각 3.11, 9.38, 10.17 그리고 9.10 g/L로 150 rpm에서 10.17 g/L로 가장 높게 나타났으며(P<0.05), 지질의 함량은 각각 39.87, 41.49, 37.19 그리고 35.51%로 50와 100 rpm 구에서 가장 높게 나타났다(P<0.05).
• DHA 함량은 교반 속도 50, 100, 150 그리고 200 rpm에서 각각 43.31, 44.10, 44.23 그리고 44.31% 로 교반속도에 따른 차이는 나타나지 않았으며(P<0.05), DHA생산량은 각각 0.54, 1.72, 1.67 그리고 1.40으로 교반속도 100과 150 rpm 구에서 가장 높게 나타났다 (P<0.05).
• 05). 이상의 결과로 DHA생산에 따른 가장 적합한 pH는 pH 7로 나타났다. 또한 대부분의 미생물들은 pH 6.
• 이상의 결과로 DHA생산에 따른 가장 적합한 pH는 pH 7로 나타났다. 또한 대부분의 미생물들은 pH 6.5-7.5의 중성적인 환경에서 잘 생육하는 것과 비슷한 결과를 보이지만 다른 미생물에 비하여 S. mangrovei의 성장에는 pH에 의한 영향을 크게 받지 않는 것으로 나타났다.
• 05). 이상의 결과로 DHA생산에 따른 가장 적합한 교반속도는 100과 150 rpm 로 나타났다.
• 균체량은 접종 후 24, 48 그리고 72 시간동안 배양하였을 때 각각 2.80, 6.80 그리고 10.60 g/L로 급격한 균체성장을 보였지만, 72 시간 이후부터는 성장이 둔화되면서 96, 120 그리고 144시간째 각각 11.30, 10.90 그리고 10.65 g/L으로 균체량의 증가는 없었다(P<0.05).
• DHA는 starch 구에서 45.08%로 가장 높게 나타났으며 (P<0.05), 다음으로 glucose, maltose 그리고 glycerol구에서 각각 43.66, 43.07 그리고 43.05%로 높게 나타났다.
• 그 결과 균체량은 glucose 구에서 10.75 g/L 로 가장 높게 나타났으며, 다음으로 fructose구에서는 9.25 g/ L로 단당류에서 높은 균체량을 보였으며(P<0.05), glycerol구와 starch구에서는 각각 7.61 g/L와 7.10 g/L로 나타났다.
• 또한 DHA생산량은 배양시간이 24, 48, 72, 96, 120 그리고 144시간 배양시간 동안 각각 0.68, 1.50, 1.71, 1.70, 1.48 그리고 1.43 g/L로 72시간과 96시간 배양에서 가장 많은 DHA를 생산하는 것으로 나타났다(P<0.05).
• 배양시간이 24, 48, 72, 96, 120 그리고 144시간 배양하는 동안 지질함량 변화는 각각 41.43, 39.41, 33.58, 33.27, 30.83 그리고 31.92%로 배양시간이 길어짐에 따라 지질 함량은 낮아지는 경향을 보였으며(P<0.05), DHA 함량은 각각 58.70, 56.10, 47.90, 45.30, 44.10 그리고 42.20%로 접종 후 24시간 일 때 가장 높았으며(P<0.05), 배양시간이 길어짐에 따라 DHA함량은 낮아지는 것으로 나타났다(P<0.05).
• 05). 이상의 결과로 DHA 생산에 가장 적합한 배양 시간은 72시간으로 나타났다.
• 질소원에 따른 균체량은 yeast extract구에서 8.40 g/ L으로 가장 높게 나타났으며(P<0.05), 다음으로 tryptone구와 sodium nitrate구에서 각각 7.30과 7.00 g/L로 나타났다.
• C/N 비율에 따른 DHA 함량은 C/N 비율이 1일 때 48.82%로 가장 높게 나타났으며(P<0.05), C/N 비율 5, 10, 15, 20, 그리고 25에서 각각 47.10, 45.41, 44.33, 41.17 그리고 42.44%로 C/N 비율이 높아짐에 따라 DHA는 감소하는 것으로 나타났다(P<0.05).
• 균체량은 C/N 비율이 1, 5, 10, 15, 20, 그리고 25에서 각각 1.10, 5.75, 10.62, 12.44, 13.82 그리고 15.80 g/L로 C/N 비율이 증가됨에 따라 균체량도 증가되었지만(P<0.05), C/N 비율이 10이상일 때, 균체량 수율의 증가비율이 낮아지는 것으로 나타났다.
• DHA생산량은 yeast extract를 사용하였을 때 1.70 g/L로 가장 높게 나타났으며(P<0.05), sodium nitrate구와 peptone 구에서 각각 1.24 g/L와 1.19 g/L로 나타났다.
• 지질 함량은 sodium nitrate구와 yeast extract구에서 각각 45.29%와 45.00%로 가장 높게 나타났으며(P<0.05), 다음으로 urea구에서 44.07%로 나타났다.
• 34 g/L로 나타났다. 이상의 결과로 DHA를 생산하기 위한 가장 적당한 탄소원은 glucose로 나타났다.
• 19 g/L로 나타났다. 이상의 결과로 DHA를 생산하기 위한 가장 적당한 질소원은 yeast extract 로 나타났다.
• 05). 이상의 결과로 C/N 비율이 높아짐에 따라 생산되는 균체량은 증가 하였지만, C/N 비율이 10이상에서 성장이 현저히 둔화되기 때문에 C/N 비율은 10일 때 가장 적합한 것으로 나타났다. 배지의 질소량은 녹조류, 세균, 곰팡이의 포화지방산과 불포화지방산의 비율에 영향을 준다고 알려져 있다(Yokochi et al.
• , 2007). 이상의 결과에서 해양미생물의 종에 따른 고도불포화지방산 생성 능력이 우수한 종을 찾아내는 것도 중요하지만, 배양 환경에 따른 물리적인 환경 조건과 영양성분에 따른 생리적인 조건을 적절하게 조절하는 것이 무엇보다 중요하다고 생각된다. 이러한 점을 고려하여 더 많은 연구가 이루어진다면 더욱 우수한 양질의 지질과 보다 많은 양의 DHA를 생산할 수 있을 것으로 사료된다.
• 염분농도 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu에서 배양한 균체량 수율은 각각 6.00, 10.10, 10.30, 8.25 그리고 5.10 g/L로 염분농도가 20과 30 psu일 때 가장 높게 나타났으며(P<0.05), 이 때 지질함량은 각각 42.17, 41.78, 37.18, 38.30 그리고 31.18%로 염분농도가 높아짐에 따라 지질 함량이 낮아지는 것으로 나타났다(P<0.05).
• 탄소원에 따른 DHA생산량은 glucose 구에서 2.10 g/L으로 가장 높게 나타났으며(P<0.05), fructose와 glycerol 구에서 각각 1.41 g/L와 1.34 g/L로 나타났다.

후속연구

• 이상의 결과에서 해양미생물의 종에 따른 고도불포화지방산 생성 능력이 우수한 종을 찾아내는 것도 중요하지만, 배양 환경에 따른 물리적인 환경 조건과 영양성분에 따른 생리적인 조건을 적절하게 조절하는 것이 무엇보다 중요하다고 생각된다. 이러한 점을 고려하여 더 많은 연구가 이루어진다면 더욱 우수한 양질의 지질과 보다 많은 양의 DHA를 생산할 수 있을 것으로 사료된다.

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질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
DHA의 주요 공급원	DHA의 주요 공급원은 무엇인가?	이러한 DHA의 중요성이 제기됨과 동시에 그것을 무엇으로부터 어떻게 확보하느냐 하는 것도 중요한 과제가 되었다. DHA는 특이하게도 화학 합성이 용이하지 못하여 천연물에서 얻어져야 되는데, 지금까지 산업적으로 DHA의 주요 공급원은 고등어, 꽁치, 참치, 전갱이, 정어리, 청어 등과 같은 등 푸른 생선의 기름에서 추출되어 왔다(Haglund et al., 1991).
DHA	DHA의 효능은?	Docosahexaenoic acid (DHA)는 eicosapentaenoic acid (EPA), α-linolenic acid와 함께 오메가-3계 지방산에 속하며, serum triacylglycerides 및 LDL-cholesterol의 함량을 낮추고 HDL-cholesterol 수치를 높임으로써 동맥경화 및 혈전증 등과 같은 심혈관계 질환의 예방에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다(Lee and Kim, 2001; Ohr, 2003). 또한 두뇌, 신경계 및 안구 조직의 필수지방산으로 특히, 유아의 시력 및 운동능력 개발 등에 중요한 요소이며 뇌의 구조적 지질에 가장 풍부한 구성요소 중의 하나이다(Horrocks and Yeo, 1999).
DHA	DHA가 중요한 이유는 무엇인가?	Docosahexaenoic acid (DHA)는 eicosapentaenoic acid (EPA), α-linolenic acid와 함께 오메가-3계 지방산에 속하며, serum triacylglycerides 및 LDL-cholesterol의 함량을 낮추고 HDL-cholesterol 수치를 높임으로써 동맥경화 및 혈전증 등과 같은 심혈관계 질환의 예방에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다(Lee and Kim, 2001; Ohr, 2003). 또한 두뇌, 신경계 및 안구 조직의 필수지방산으로 특히, 유아의 시력 및 운동능력 개발 등에 중요한 요소이며 뇌의 구조적 지질에 가장 풍부한 구성요소 중의 하나이다(Horrocks and Yeo, 1999). 이러한 DHA의 중요성이 제기됨과 동시에 그것을 무엇으로부터 어떻게 확보하느냐 하는 것도 중요한 과제가 되었다.

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