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문제 정의
- 미토콘드리아 외막에 존재하는 Bcl-2 family 단백질은 cytochrome c의 방출을 조절함으로써 apoptosis를 조절하며(Reed JC 1998b, Korsmeyer SJ 1995), caspase는 initiator caspase와 effector caspase로 구분되며, 세포 사멸 조절 인자로 작용하는데, 이 중 caspase-9은 apoptosis initiator로 작용하며, 미토콘드리아 막의 투과성이 증가되어 세포질로 방출된 cytochromec에 의해 활성화되고(Cory et al 2003), apoptosis의 형태학적 특징에 관여하는 PARP에 영향을 주어(Villa et al 1997) apoptosis를 유도한다(Chae et al 2011, Debatin KM 2004). 본 연구에서는 HT-29 세포에서 세포 사멸을 유도한 연근 추출물이 caspase의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해, ca- spase 활성 형태인 cleaved caspase들의 단백질 수준을 관찰하기 위해, Western blot을 시행하였다. HT-29 세포에 연근 추출물을 처리한 뒤 control로 사용된 β-actin과 비교하였을 때 Bcl-2밴드가 감소하였고, 반면에 Bax 밴드가 증가됨을 확인할 수있었다.
- 이에 따라 본 연구는 인체 암세포 증식을 저해시키는 천연 소재 발굴을 목적으로, 선행 연구에서 효능이 확인된 연근 추출물의 HT-29 대장암 세포 증식 억제 및 세포 사멸을 확인하였다. 또한 FACS, Western blotting 및 RT-PCR 실험을 통해 암세포 사멸 기전을 규명하여 인체 대장암세포 성장 저해제로서의 연근의 활용 가능성을 확인하였다.
제안 방법
- HT-29 세포를 1×106 cells/mL 농도로 6 well plate에 분주하고, 시료 추출물을 0, 1, 3, 5 mgmL 농도로 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 sample을 모아 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 protein lysis buffer를 넣어 세포를 파괴한 후 4℃, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 모아 시료로 사용하였다. 12% gradient SDSPAGE에서 동량의 단백질을 loading하여 단백질을 분리한 후, nitrocellulose membrane에 1차 antibody를 4℃, overnight 반응시키고, TBST로 15분간 3회씩 세척한 후 다시 2차 goat anti-rabbit IgG-HRP(Santa Cruz Biotech Inc., USA)로 1시간 동안 반응시키고, TBST로 15분간 3회씩 씻어낸 후, ECL solution으로 확인하였다(Ryu et al 2014).
- HT-29 세포의 증식 억제가 apoptosis 또는 necrosis에 기인하는지 확인하기 위해 Flow cytometery 분석을 수행하였다. Apoptosis가 일어나면 세포막을 조성하는 인지질의 안쪽에 위치한 phosphatidyl serine(PS)이 세포막 밖으로 이동하는 원리를 이용한 방법으로 PS에 특이적으로 결합하는 Annexin V와 popidium iodidie(PI)의 세포막 투과성을 이용하여 세포 중의 early apoptosis(Annexin V-FITC positive, PI negative), late apoptosis(Annexin V-FITC positive, PI positive)의 비율을 확인하였다. 실험 결과, 시료를 처리하지 않은 대조군에서 early apoptosis 13.
- HT-29 대장암 세포에 시료를 처리하였을 때 농도가 증가할수록 세포 성장이 감소하였으며, 현미경 관찰에서도 세포 형태가 변하는 것이 확인되었으므로, HT-29 세포에 연근 추출물을 농도별로 처리하였을 때 apoptosis를 나타내는 형태학적 변화를 관찰하기 위하여, DNA에 특이적으로 결합하는 형광 색소인 Hoechst 33342 용액으로 염색한 후 형광 현미경에서 관찰하였다. 핵 염색으로 조사한 결과, 시료를 처리하지 않은 대조군에서는 HT-29 세포핵은 아무런 손상 없이 둥근 모양으로 일정한 반면, 연근 추출물을 1, 3, 5 mg/mL 처리한 모든 군에서 HT-29 세포 수가 감소하였으며, 세포의 핵이 손상되어 절편이 되었고, 세포 크기도 감소하는 등 형태학적 변화들이 뚜렷하게 관찰되었다.
- HT-29 및 HCT116 세포에 연근 추출물을 0, 1, 3, 5 mg/mL 농도로 처리하고, 각각을 24시간 동안 배양하여 MTT시약을 첨가한 후 살아있는 세포의 미토콘드리아 탈수소 효소 반응에 의해 형성되는 보라색 formazan을 확인하고, 이를 DMSO로 용해시켜 흡광도를 측정하였다. 실험 결과, 대조군에서는 모든 세포에서 진한 보라색의 formazan이 형성되었으나, 연근 추출물을 처리한 군에서는 시료 농도가 증가함에 따라 모든 세포에서 보라색이 감소하였고, 시료 농도 의존적으로 세포 사멸이 증가함을 확인할 수 있었다.
- HT-29 및 HCT116 세포에 연근 추출물을 처리하였을 때 세포 증식이 감소하였으며, 이 중 효능이 다소 높은 것으로 확인된 HT-29 세포의 형태학적인 변화를 살펴보기로 하였다. 시료를 처리하지 않은 대조군의 경우 plate 바닥에 세포가 안정적으로 부착되어 정상적인 증식이 이루어진 모습이 관찰되었으나, 시료를 처리한 시험군의 경우, 농도별로 세포증식이 감소하였고, plate로 부터 세포가 분리되어 배양액에 부유한 모습이었다.
- HT-29 세포를 6 well plate에 1×106 cells/cm2 밀도로 분주하여 24시간 배양한 후, 시료 추출물을 0, 1, 3, 5 mg/mL 농도로 첨가하여 24시간 동안 배양하였다.
- HT-29 세포에 연근 추출물을 0, 1, 3, 5 mg/mL 농도로 24시간 처리하여 대조군과 비교하였을 때, 시료 농도가 증가할수록 세포 증식이 유의적으로 감소되고, 세포 사멸은 증가되는 실험 결과를 근거로, 연근 추출물이 HT-29 대장암 세포의 mRNA 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위해 세포 사멸과 관련된 유전자를 이용하여 실험하였다. 세포 사멸을 억제하는 유전자인 Bcl-2와 사멸을 유도하는 Bax를 통해 대조군인 β-actin과 비교 분석하였다.
- HT-29 세포의 apoptosis 비율을 측정하기 위해 flow cytometry 실험을 수행하였다. HT-29 세포를 6 well plate에 1×106 cells/cm2 밀도로 분주하여 24시간 배양한 후, 시료 추출물을 0, 1, 3, 5 mg/mL 농도로 첨가하여 24시간 동안 배양하였다.
- RT-PCR은 Ryu et al (2013) 방법에 의해 수행되었다. HT-29 세포의 증식 억제 및 사멸 유도 효과가 mRNA 수준에서도 영향을 미치는지 알아보기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 세포를 6 well plate에 3×105 cells/cm2 밀도로 분주한 후, 시료를 농도별로 처리하고, 24시간 후 scraper로 sample을 모은 후 Trizol reagent 1 mL를 첨가하여 3분간 실온에 방치하였다.
- HT-29 세포의 증식 억제가 apoptosis 또는 necrosis에 기인하는지 확인하기 위해 Flow cytometery 분석을 수행하였다. Apoptosis가 일어나면 세포막을 조성하는 인지질의 안쪽에 위치한 phosphatidyl serine(PS)이 세포막 밖으로 이동하는 원리를 이용한 방법으로 PS에 특이적으로 결합하는 Annexin V와 popidium iodidie(PI)의 세포막 투과성을 이용하여 세포 중의 early apoptosis(Annexin V-FITC positive, PI negative), late apoptosis(Annexin V-FITC positive, PI positive)의 비율을 확인하였다.
- Hoechst 33342 최종 농도가 2 ug/mL가 되도록 PBS에 희석하여 세포에 첨가하고, 15분 동안 어두운 곳에서 염색한 후 형광 현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다(Ryu & Chung 2011).
- 대장 정상 세포(FHC)를 이용하여 시료의 세포 독성을 확인한 결과, 시료 농도가 0, 1, 3, 5 mg/mL에서 FHC가 증식되는 것이 확인되었으므로(Fig. 1), 이후 실험에 사용되는 시료농도를 0∼5 mg/mL로 설정하였다.
- 이에 따라 본 연구는 인체 암세포 증식을 저해시키는 천연 소재 발굴을 목적으로, 선행 연구에서 효능이 확인된 연근 추출물의 HT-29 대장암 세포 증식 억제 및 세포 사멸을 확인하였다. 또한 FACS, Western blotting 및 RT-PCR 실험을 통해 암세포 사멸 기전을 규명하여 인체 대장암세포 성장 저해제로서의 연근의 활용 가능성을 확인하였다.
- 세포 단층을 PBS로 2회 씻어낸 후 trysin-EDTA로 처리하여 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하고, 세포들을 수집한 후 Annexin V와 Propidium Iodide로 염색한 후, FACS analysis(Beckman Coulter, USA)를 통해 apoptotic cell 수를 측정하였다(Ryu & Chung 2011).
- 세포 사멸과 증식과 관련된 특정 단백질의 발현을 western blot을 실시하여 확인하였다. HT-29 세포를 1×106 cells/mL 농도로 6 well plate에 분주하고, 시료 추출물을 0, 1, 3, 5 mgmL 농도로 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 sample을 모아 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 protein lysis buffer를 넣어 세포를 파괴한 후 4℃, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 모아 시료로 사용하였다.
- 세포 사멸을 억제하는 유전자인 Bcl-2와 사멸을 유도하는 Bax를 통해 대조군인 β-actin과 비교 분석하였다.
- 세포를 96 well plate에 1×104 cells/cm2 밀도가 되도록 분주하여 시료를 0, 1, 3, 5 mg/mL 농도로 24시간 배양한 후 MTT 시약을 2 mg/mL 농도로 50 µL를 각 well에 처리하여 37℃에서 4시간 반응시킨 후 배지를 제거하고 DMSO를 넣어 형성된 formazan 크리스탈을 용해시켜 540 nm에서 Microplate reader(Bio-Rad, USA)로 흡광도를 측정하였다. 세포증식률은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었고, 실험은 각 실험군마다 3 wells의 흡광도를 각각 측정하여 평균값을 계산하였고, 3회 반복 실시하였다(Ryu et al 2013).
- 연근 추출물에 대한 HT-29 대장암 세포의 증식 억제가 apoptosis에 의한 것인지를 확인하기 위하여 Annexin V-PI staining을 통해 apoptosis로 사멸하는 세포의 비율이 시료 농도가 증가할수록 비례적으로 증가하는 것이 확인되었다. 연근 추출물 처리에 따른 apoptosis 조절인자들의 영향을 western blot과 RT-PCR을 통하여 관찰하였다. 실험 결과, Bcl-2는 연근 추출물의 농도가 증가할수록 밴드가 감소하는 것으로 나타났고, Bax는 농도 의존적으로 증가하는 것으로 확인되었다.
- 준비된 sample에 2.5 mix buffer(10×PCR buffer, 50 mM MgCl2, 10 mM NTP mix, autoclave water)와 sense, antisense primer Taq polymerase를 혼합하여 cycle을 실행하며, ethidium bromide로 염색한 1% agarose gel로 전기영동을 실시하고, Gel Documentation System(Bio-Rad, USA)으로 밴드 결과를 확인하였다.
대상 데이터
- 대장 정상 세포(FHC, CRL-1831TM) 및 Human colon epithelial cell인 HT-29, HCT116 세포는 ATCC(USA) 및 Korea Cell Line Bank(Seoul, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 분주 받은 세포주를 10% heat-inactivated FBS와 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 RPMI-1640 배지를 사용하여 5% CO2를 함유한 37℃ 배양기(Sanyo, Japan)에서 2주 이상 계대배양하여 배양 환경에 충분히 적응시킨 후, 세포 밀도가 70∼80% 정도 포화되면 0.
- 여과된 추출액을 rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan)로 감압 농축한 후 —80℃에서 동결건조(Ope- ron, Korea)하였다. 분말 시료를 제조하여 건조물의 무게를 측정한 후(수득량 : 1.6435 g), 100% 증류수에 녹여 실험에 사용하였다.
- 분주 받은 세포주를 10% heat-inactivated FBS와 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 RPMI-1640 배지를 사용하여 5% CO2를 함유한 37℃ 배양기(Sanyo, Japan)에서 2주 이상 계대배양하여 배양 환경에 충분히 적응시킨 후, 세포 밀도가 70∼80% 정도 포화되면 0.05% Trypsin-EDTA 용액을 사용하여 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 실험 재료인 연근은 2012년 5월, 양재동 소재 농협 하나로마트에서 구매하여 사용하였다. 깨끗이 씻은 연근을 껍질을 벗기지 않은 상태로 상온에서 2일 동안 건조시킨 후, 건조물 10g을 70% ethanol로 80℃ water bath에서 1시간 동안 추출하고, 이 과정을 3회 반복하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 SPSS 12.0 프로그램을 이용하여 각 실험군의 평균과 표준편차로 계산하고, ANOVA 분석 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하여 대조군과 처리군 간의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- HT-29 및 HCT116 세포의 증식 정도를 MTT assay로 측정하였다. 세포를 96 well plate에 1×104 cells/cm2 밀도가 되도록 분주하여 시료를 0, 1, 3, 5 mg/mL 농도로 24시간 배양한 후 MTT 시약을 2 mg/mL 농도로 50 µL를 각 well에 처리하여 37℃에서 4시간 반응시킨 후 배지를 제거하고 DMSO를 넣어 형성된 formazan 크리스탈을 용해시켜 540 nm에서 Microplate reader(Bio-Rad, USA)로 흡광도를 측정하였다.
- RT-PCR은 Ryu et al (2013) 방법에 의해 수행되었다. HT-29 세포의 증식 억제 및 사멸 유도 효과가 mRNA 수준에서도 영향을 미치는지 알아보기 위하여 RT-PCR을 수행하였다.
성능/효과
- HT-29 세포에 연근 추출물을 처리한 뒤 control로 사용된 β-actin과 비교하였을 때 Bcl-2밴드가 감소하였고, 반면에 Bax 밴드가 증가됨을 확인할 수있었다.
- 이는 caspases 활성이 연근 추출물에 의한 세포사멸 과정에 중요한 조절 인자로 작용했음을 확인할 수 있었다. 따라서 연근 추출물은 caspase-9의 경로를 통해 apoptosis가 일어나는 것이 확인되었다.
- 연근 추출물에 의한 세포 형태는 연근 추출물의 농도가 증가할수록 세포 증식이 감소하고, 세포가 배양액에 부유한 양상을 보여주었고, 시료농도 3 mg/mL 부터 세포 형태가 변화하기 시작하였으며, 시료 최고 농도인 5 mg/mL에서는 세포의 응축현상과 일부 부유한 세포 중 세포막이 파괴되어 세포의 사멸이 이루어짐을 알 수 있었다. 또한 Hoechst 33342 용액으로 염색한 결과, 시료 농도 의존적으로 세포수가 감소되었고, apoptotic body 등과 같은 형태학적 변화들을 관찰할 수 있었다.
- 연근 추출물을 농도별로 처리하였을 때 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2가 감소하고, pro-apoptotic 단백질인 Bax가 증가하였으므로, 이는 미토콘드리아 막 투과성을 조절하는 Bcl-2 family에 의해 cytochromec의 방출이 증가하면서 apoptosis가 조절되는 것으로 추정할 수 있다(Koesmeyer et al 1993). 또한 cleaved caspase-3와 cleaved caspase-9, 그리고 PARP의 밴드가 증가하고, pro caspase-3는 감소되었다.
- HT-29 세포에 연근 추출물을 처리한 뒤 control로 사용된 β-actin과 비교하였을 때 Bcl-2밴드가 감소하였고, 반면에 Bax 밴드가 증가됨을 확인할 수있었다. 또한 cleaved caspase-3와 cleaved caspase-9이 증가하였고, 분절된 PARP도 시료 농도에 의존적으로 증가하였다(Fig. 6). 즉, 연근 추출물 처리에 의한 initiator caspase인 cleaved caspase-9의 발현은 처리 농도에 의존적으로 증가되었고, 활성화된 cleaved caspase-9에 의해 effector caspase인 cleaved caspase-3를 활성화하여 세포 사멸을 유도한 것임을 확인하였다.
- 시료를 처리하지 않은 대조군의 경우 plate 바닥에 세포가 안정적으로 부착되어 정상적인 증식이 이루어진 모습이 관찰되었으나, 시료를 처리한 시험군의 경우, 농도별로 세포증식이 감소하였고, plate로 부터 세포가 분리되어 배양액에 부유한 모습이었다. 또한 시료 농도 3 mg/mL에서 세포 형태가 변화하기 시작하였으며, 5 mg/mL 처리 시 세포 응축현상이 나타나기 시작하고, 부유한 세포들 중 일부는 세포막이 파괴되어 세포사멸이 이루어짐을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 이 둘은 서로 dimer로 존재하며 균형을 이루고 있지만, 균형이 깨어지게 되면 미토콘드리아로부터 cytochrome C의 방출이 증가되어 caspase cascade의 활성화를 통해 세포 사멸을 유도하게 된다(Adams & Cory 1998). 본 실험에서 연근 추출물을 처리하였을 때 암 억제 유전자인 Bax의 mRNA 발현은 증가하였고, Bcl-2의 발현은 감소되었으므로 연근 추출물이 HT-29 세포사멸을 유발시키는 것으로 확인되었다. 이는 연근 추출물이 MDA-MB-231 세포 증식을 억제한다는 보고(Rajendra et al 2008)와 함께 연근 추출물이 in vitro에서 특정 암세포의 성장을 억제시키는 것으로 확인되었으며, 본 연구에서도 연근 추출물 농도가 높을수록 HT-29 세포 생존율이 유의적으로 감소되었으며, 특히 3 mg/mL의 농도에서 약 50%의 감소가 확인되었다(P<0.
- 연근 추출물 처리에 따른 apoptosis 조절인자들의 영향을 western blot과 RT-PCR을 통하여 관찰하였다. 실험 결과, Bcl-2는 연근 추출물의 농도가 증가할수록 밴드가 감소하는 것으로 나타났고, Bax는 농도 의존적으로 증가하는 것으로 확인되었다. 연근 추출물을 농도별로 처리하였을 때 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2가 감소하고, pro-apoptotic 단백질인 Bax가 증가하였으므로, 이는 미토콘드리아 막 투과성을 조절하는 Bcl-2 family에 의해 cytochromec의 방출이 증가하면서 apoptosis가 조절되는 것으로 추정할 수 있다(Koesmeyer et al 1993).
- HT-29 및 HCT116 세포에 연근 추출물을 0, 1, 3, 5 mg/mL 농도로 처리하고, 각각을 24시간 동안 배양하여 MTT시약을 첨가한 후 살아있는 세포의 미토콘드리아 탈수소 효소 반응에 의해 형성되는 보라색 formazan을 확인하고, 이를 DMSO로 용해시켜 흡광도를 측정하였다. 실험 결과, 대조군에서는 모든 세포에서 진한 보라색의 formazan이 형성되었으나, 연근 추출물을 처리한 군에서는 시료 농도가 증가함에 따라 모든 세포에서 보라색이 감소하였고, 시료 농도 의존적으로 세포 사멸이 증가함을 확인할 수 있었다. 특히 시료의 최고 농도인 5 mg/mL 처리 시, HT-29 세포에서는 48.
- Apoptosis가 일어나면 세포막을 조성하는 인지질의 안쪽에 위치한 phosphatidyl serine(PS)이 세포막 밖으로 이동하는 원리를 이용한 방법으로 PS에 특이적으로 결합하는 Annexin V와 popidium iodidie(PI)의 세포막 투과성을 이용하여 세포 중의 early apoptosis(Annexin V-FITC positive, PI negative), late apoptosis(Annexin V-FITC positive, PI positive)의 비율을 확인하였다. 실험 결과, 시료를 처리하지 않은 대조군에서 early apoptosis 13.1%, late apoptosis가 8.4% 발생되어, 총 진행된 세포 사멸이 21.5%이었으며, 1 mg/mL 농도에서는 early apoptosis 21.3%, late apoptosis 9.9%로 세포 사멸이 총 31.2%로 나타났고, 3 mg/mL 농도에서는 early apoptosis 37.7%, late apoptosis 10.9%로 총 48.6%이며, 5 mg/mL 농도에서는 early apoptosis 52.3%, 그리고 late apoptosis 14.2%로 세포 사멸이 총 66.5%로 시료 처리 농도에 비례하는 것으로 확인되었다(Fig. 5).
- 세포 사멸을 억제하는 유전자인 Bcl-2와 사멸을 유도하는 Bax를 통해 대조군인 β-actin과 비교 분석하였다. 실험 결과, 연근 추출물의 농도가 증가할수록 Bcl-2의 mRNA 발현이 농도 의존적으로 감소하였으며, 반대로 Bax의 발현은 증가되었다(Fig. 7). Bcl-2 family는 미토콘드리아의 막 투과성과 cytochrome C를 통해 세포사멸을 조절하는 것으로 알려져 있다.
- 연근 추출물에 대한 HT-29 대장암 세포의 증식 억제가 apoptosis에 의한 것인지를 확인하기 위하여 Annexin V-PI staining을 통해 apoptosis로 사멸하는 세포의 비율이 시료 농도가 증가할수록 비례적으로 증가하는 것이 확인되었다. 연근 추출물 처리에 따른 apoptosis 조절인자들의 영향을 western blot과 RT-PCR을 통하여 관찰하였다.
- 2%의 세포 생존율을 나타내었다. 연근 추출물에 의한 세포 형태는 연근 추출물의 농도가 증가할수록 세포 증식이 감소하고, 세포가 배양액에 부유한 양상을 보여주었고, 시료농도 3 mg/mL 부터 세포 형태가 변화하기 시작하였으며, 시료 최고 농도인 5 mg/mL에서는 세포의 응축현상과 일부 부유한 세포 중 세포막이 파괴되어 세포의 사멸이 이루어짐을 알 수 있었다. 또한 Hoechst 33342 용액으로 염색한 결과, 시료 농도 의존적으로 세포수가 감소되었고, apoptotic body 등과 같은 형태학적 변화들을 관찰할 수 있었다.
- 이는 연근 추출물이 MDA-MB-231 세포 증식을 억제한다는 보고(Rajendra et al 2008)와 함께 연근 추출물이 in vitro에서 특정 암세포의 성장을 억제시키는 것으로 확인되었으며, 본 연구에서도 연근 추출물 농도가 높을수록 HT-29 세포 생존율이 유의적으로 감소되었으며, 특히 3 mg/mL의 농도에서 약 50%의 감소가 확인되었다(P<0.05).
- 특히 시료 농도가 3 mg/mL에서부터 세포핵의 변화를 관찰할 수 있었으며, 시료 농도가 증가할수록 apoptosis 소체 수가 증가되는 것이 확인되었다. 이를 통해 연근 추출물에 의한 HT-29 세포 사멸은 aopotosis에 의한 것임을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 세포 사멸 과정에서 세포는 세포 외 기질에 대한 세포막 수용체인 인터그린과의 결합력 약화로 인한 focal adhesion complex의 분해 때문에 일차적으로 평평한 모양에서 둥근 형태로 모양이 변하고, 세포 내 골격 단백질의 변화로 인한 세포 수축, 염색사응축, 핵의 붕괴, DNA 분해 등과 같은 다양하고 특이한 형태적, 생화학적인 변화를 일으키는 것으로 알려져 있다(Reed JC 1998a).
- 인체대장암 세포인 HT-29 및 HCT116에 연근 70% 에탄올 추출물을 0, 1, 3, 5 mg/mL 농도로 처리하여 세포 증식을 확인한 결과, 모든 세포에서 농도 의존적으로 생존율이 감소하였고, 최고 농도인 5 mg/mL에서 HT-29, 48.8% 및 HCT116, 56.2%의 세포 생존율을 나타내었다. 연근 추출물에 의한 세포 형태는 연근 추출물의 농도가 증가할수록 세포 증식이 감소하고, 세포가 배양액에 부유한 양상을 보여주었고, 시료농도 3 mg/mL 부터 세포 형태가 변화하기 시작하였으며, 시료 최고 농도인 5 mg/mL에서는 세포의 응축현상과 일부 부유한 세포 중 세포막이 파괴되어 세포의 사멸이 이루어짐을 알 수 있었다.
- 6). 즉, 연근 추출물 처리에 의한 initiator caspase인 cleaved caspase-9의 발현은 처리 농도에 의존적으로 증가되었고, 활성화된 cleaved caspase-9에 의해 effector caspase인 cleaved caspase-3를 활성화하여 세포 사멸을 유도한 것임을 확인하였다. 이는 caspases 활성이 연근 추출물에 의한 세포사멸 과정에 중요한 조절 인자로 작용했음을 확인할 수 있었다.
- 핵 염색으로 조사한 결과, 시료를 처리하지 않은 대조군에서는 HT-29 세포핵은 아무런 손상 없이 둥근 모양으로 일정한 반면, 연근 추출물을 1, 3, 5 mg/mL 처리한 모든 군에서 HT-29 세포 수가 감소하였으며, 세포의 핵이 손상되어 절편이 되었고, 세포 크기도 감소하는 등 형태학적 변화들이 뚜렷하게 관찰되었다. 특히 시료 농도가 3 mg/mL에서부터 세포핵의 변화를 관찰할 수 있었으며, 시료 농도가 증가할수록 apoptosis 소체 수가 증가되는 것이 확인되었다. 이를 통해 연근 추출물에 의한 HT-29 세포 사멸은 aopotosis에 의한 것임을 확인할 수 있었다(Fig.
- HT-29 대장암 세포에 시료를 처리하였을 때 농도가 증가할수록 세포 성장이 감소하였으며, 현미경 관찰에서도 세포 형태가 변하는 것이 확인되었으므로, HT-29 세포에 연근 추출물을 농도별로 처리하였을 때 apoptosis를 나타내는 형태학적 변화를 관찰하기 위하여, DNA에 특이적으로 결합하는 형광 색소인 Hoechst 33342 용액으로 염색한 후 형광 현미경에서 관찰하였다. 핵 염색으로 조사한 결과, 시료를 처리하지 않은 대조군에서는 HT-29 세포핵은 아무런 손상 없이 둥근 모양으로 일정한 반면, 연근 추출물을 1, 3, 5 mg/mL 처리한 모든 군에서 HT-29 세포 수가 감소하였으며, 세포의 핵이 손상되어 절편이 되었고, 세포 크기도 감소하는 등 형태학적 변화들이 뚜렷하게 관찰되었다. 특히 시료 농도가 3 mg/mL에서부터 세포핵의 변화를 관찰할 수 있었으며, 시료 농도가 증가할수록 apoptosis 소체 수가 증가되는 것이 확인되었다.
후속연구
- 본 실험을 통해 연근 추출물이 HT-29 대장암 세포의 증식을 억제하고, 세포 사멸을 유도하는 것을 확인할 수 있었으며, 시료의 항대장암 효능을 입증하기 위하여 추후 동물 실험 및 활성물질의 기전 규명 등의 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 세포 사멸 과정에서 세포는 세포 외 기질에 대한 세포막 수용체인 인터그린과의 결합력 약화로 인한 focal adhesion complex의 분해 때문에 일차적으로 평평한 모양에서 둥근 형태로 모양이 변하고, 세포 내 골격 단백질의 변화로 인한 세포 수축, 염색사응축, 핵의 붕괴, DNA 분해 등과 같은 다양하고 특이한 형태적, 생화학적인 변화를 일으키는 것으로 알려져 있다(Reed JC 1998a). 이번 실험에서는 연근 추출물을 처리할 때 대장암 세포 사멸에 의한 행태적 변화가 일어나고 있는 것이 확인되었고, 이는 연근 추출물이 HT-29 세포의 생존율 감소 및 형태 변화에 영향을 미치는 것으로 추정되며, 추후 세포핵의 붕괴 및 DNA 분해와 관련된 보다 추가적인 대사 연구가 필요한 것으로 사료된다.
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