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문제 정의
- 본 연구에서는 LC-MS/MS를 이용한 블루베리의 methanol 과 ethyl acetate 추출 분획에 존재하는 대사체의 분석을 통해 효율적인 대사체 profiling의 가능성을 탐색하였다. LC-MS/MS에서 검출되는 대사체를 통계 처리한 결과, methanol 추출 분획에서는 5-O-feruloylquinic acid, malvidin hexoside, malvidin-3-arabinoside, petunidin-3-arabinoside, delphinidin hexoside, delphinidin, petunidin hexoside와 같은 안토시아닌 계열의 화합물들이 존재하였고, ethyl acetate 분획에서는 chlorogenic acid, chlorogenic acid dimer, 6,8-di-C-arabinopyranosylluteolin, luteolin과 같은 플라보노이드 계열의 화합물이 검출되었다.
제안 방법
- 냉동건조한 블루베리분말(2.5g)에 10mL의 ethyl acetate를 가하고 상온에서 30분간 교반 후 4°C, 4,000×g에서 10분간 원심분리(Hanil combi-514R, Incheon, Korea) 하여 상등액만 분획하는 과정을 2회 반복 실시한 뒤 이를 ethyl acetate 추출 분획으로 사용하였다.
- 대사체 추출물은 감압 농축하여 용매를 제거한 후 methanol에 용해시켜 LC-MS/MS(Accela HPLC, LTQ-Velos ion trap mass spectrometer, Thermo Fischer Scientific, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 물질의 분리는 UPLC-BEH C18 column(1.
- 블루베리 추출물에 함유된 대사체의 동정을 위해서 LC-MS/MS 분석은 최소 3회 이상 반복하였고, 얻어진 크로마토그램 peak의 detection, alignment는 SIEVE software (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 수행하였다. 물질의 정확한 동정은 MS에서 얻어진 mass값, UV/visible spectra와 MS/MS fragmentation pattern을 기반으로 하였고, 각 물질들의 MS/MS pattern과 다양한 database(ChemSpider, KEGG, PubChem, METLIN, MassBank)의 자료를 기반으로 하여 정확한 대사체 동정을 실시하였다. Ethyl acetate와 methanol 추출 분획에 함유된 대사체의 변이와 특징적인 대사체 규명을 위한 다변량 통계 분석은 SIMCA-P+software(ver.
- 블루베리와 같은 천연물에 함유된 대사체들의 분석에 있어서는 목적하는 대사체의 종류에 따라 다양한 추출법이 사용될 수 있으나 아직까지 정형화된 추출용매의 선택에 대한 정립은 이루어지지 못하고 있는 실정이다. 본 연구에 사용한 각 추출 분획에 존재하는 특징적인 대사체들의 발굴과 동정을 위해서 다변량 통계분석을 실시하여 유의적 차이를 보이는 대사체를 선발하고 이들에 대한 동정을 실시하였다. Principal component analysis(PCA) 결과 ethyl acetate 분획과 methanol 분획에 함유된 대사체들은 positive ion mode에서는 주성분1 62.
- 블루베리 대사체의 추출은 Määttä-Riihinen 등(18)의 방법을 일부 수정하여 ethyl acetate와 methanol을 이용하여 실시하였다.
- 블루베리 추출물에 함유된 대사체의 동정을 위해서 LC-MS/MS 분석은 최소 3회 이상 반복하였고, 얻어진 크로마토그램 peak의 detection, alignment는 SIEVE software (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 수행하였다. 물질의 정확한 동정은 MS에서 얻어진 mass값, UV/visible spectra와 MS/MS fragmentation pattern을 기반으로 하였고, 각 물질들의 MS/MS pattern과 다양한 database(ChemSpider, KEGG, PubChem, METLIN, MassBank)의 자료를 기반으로 하여 정확한 대사체 동정을 실시하였다.
- 용매 조건은 용매 B를 40분 동안 90%까지 linear gradient를 가하였고, 칼럼의 온도는 36°C로, 180~800 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
- 최근 대사체학을 이용하여 국내산 복분자에 함유된 대사체들을 규명하는등 식품학 분야에 적극적으로 이용되고 있으나(2,17), 블루베리에 함유된 유용 대사체들에 대한 분석 시도는 아직까지 보고된 바 없다. 이에 본 연구에서는 대사체 추출에 널리 이용되는 ethyl acetate와 methanol 추출물에 함유된 대사체를 LC-MS/MS를 이용하여 분석하고 이들 대사체의 profiling을 비교 분석하였다.
- 2). 좀더 세부적인 대사체들의 변이 분석을 위해서 OPLS-DA 분석을 실시하고 5% 유의수준에서 두 가지 용매 분획에 함유된 특이적인 대사체들의 존재를 확인하여 관련 대사체들의 동정을 실시하였다(Fig. 3, Table 1). 동정 결과 positiveion mode에서는 5-O-feruloylquinic acid, malvidin hexoside, malvidin-3-arabinoside, petunidin-3-arabi-noside, delphinidin 등의 대사체들이 methanol 분획에 존재하는 특이적인 화합물들로 나타났고, ethyl acetate 분획에는 chlorogenic acid, 6,8-di-C-arabinopyranosyl-luteolin, luteolin이 동정되었다(Table 1).
대상 데이터
- MS 정보는 positive와 negative ion mode 모두 100~1,000 kDa에서 수집하였고, capillary 온도는 275°C, source voltage는 5 kV로 조정하였다.
- 본 실험에 사용된 블루베리는 국내에서 재배되는 spartan 품종으로 농장에서 친환경 농법으로 재배, 수확한 블루베리를 사용하였다. 수확 후 저장 중 대사체의 변이를 방지 하기 위해 농장에서 수확한 블루베리는 냉장상태로 바로 실험실로 운반 후 세척, 냉동건조 과정을 거친 후 -80°C 냉동고에 저장하면서 실험에 사용하였다.
- 수확 후 저장 중 대사체의 변이를 방지 하기 위해 농장에서 수확한 블루베리는 냉장상태로 바로 실험실로 운반 후 세척, 냉동건조 과정을 거친 후 -80°C 냉동고에 저장하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- Ethyl acetate와 methanol 추출 분획에 함유된 대사체의 변이와 특징적인 대사체 규명을 위한 다변량 통계 분석은 SIMCA-P+software(ver.12.0, Umetrics, Umeå, Sweden)로 principal component analysis(PCA)와 orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA)를 이용하여 실시하였다.
성능/효과
- Positive ion mode의 ethyl acetate 분획에서는 chlorogenic acid와 luteolin에 당이 결합한 배당체 화합물이 주요 화합물로 검출되었고, methanol 분획에서는 feruloylquinic acid와 함께 delphinidin, petunidin, malvidin과 같은 안토시아닌 계통 화합물들의 배당체들이 다양하게 검출 되는 것을 확인할 수 있었다.
- 1에 정리하였다. Ethyl acetate와 methanol 추출 분획 모두에서 positive ion mode보다는 negative ion mode에서 좀 더 다양한 대사체가 검출되었고, ethyl acetate 분획에서는 플라보노이드 계통의 화합물들이 주로 검출되었으며, methanol 분획에서는 안토시아닌 계통의 색소 관련 화합물들이 주로 검출되는 것을 볼 수 있었다. Positive ion mode의 ethyl acetate 분획에서는 chlorogenic acid와 luteolin에 당이 결합한 배당체 화합물이 주요 화합물로 검출되었고, methanol 분획에서는 feruloylquinic acid와 함께 delphinidin, petunidin, malvidin과 같은 안토시아닌 계통 화합물들의 배당체들이 다양하게 검출 되는 것을 확인할 수 있었다.
- 특히 블루베리와 같은 과실류에 존재하는 2차 대사산물인 폴리페놀 관련 대사체의 분석에 있어서는 기존의 분석법에서는 불가능했던 물질의 동정과 선발이 가능하게 된다. Fig.3에 나타난 바와 같이 positive와 negative ion mode 모두에서 methanol과 ethyl acetate 분획으로 추출할 수 있는 특징적인 대사체들을 OPLS-DA 분석을 통해서 손쉽게 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서는 LC-MS/MS를 이용한 블루베리의 methanol 과 ethyl acetate 추출 분획에 존재하는 대사체의 분석을 통해 효율적인 대사체 profiling의 가능성을 탐색하였다. LC-MS/MS에서 검출되는 대사체를 통계 처리한 결과, methanol 추출 분획에서는 5-O-feruloylquinic acid, malvidin hexoside, malvidin-3-arabinoside, petunidin-3-arabinoside, delphinidin hexoside, delphinidin, petunidin hexoside와 같은 안토시아닌 계열의 화합물들이 존재하였고, ethyl acetate 분획에서는 chlorogenic acid, chlorogenic acid dimer, 6,8-di-C-arabinopyranosylluteolin, luteolin과 같은 플라보노이드 계열의 화합물이 검출되었다. 본 연구는 기존 연구와 달리 대사체학 기법을 이용한 블루베리 추출물 전체 대사물질의 profiling을 시도한 최초의 연구로서 블루베리에 함유된 유용 성분의 스크리닝등 향후 응용 연구에 유용한 기반으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 2). Negative ion mode에서 검출된 대사체들의 경우는 positive ion mode와 다르게 대사체들 간 변이의 92.7%가 주성 분1에 의해 유의적인 차이를 나타내고 있었다(Fig. 2). 좀더 세부적인 대사체들의 변이 분석을 위해서 OPLS-DA 분석을 실시하고 5% 유의수준에서 두 가지 용매 분획에 함유된 특이적인 대사체들의 존재를 확인하여 관련 대사체들의 동정을 실시하였다(Fig.
- 동정 결과 positiveion mode에서는 5-O-feruloylquinic acid, malvidin hexoside, malvidin-3-arabinoside, petunidin-3-arabi-noside, delphinidin 등의 대사체들이 methanol 분획에 존재하는 특이적인 화합물들로 나타났고, ethyl acetate 분획에는 chlorogenic acid, 6,8-di-C-arabinopyranosyl-luteolin, luteolin이 동정되었다(Table 1). Negative ion mode에서는 5-O-feruloylquinic acid, delphinidin hexoside, petunidin hexoside와 같이 주로 안토시아닌 계열의 화합물들이 존재하였고, ethyl acetate 분획에서는 플라보노이드 계열의 화합물들인 chlorogenic acid, chlorogenic acid dimer, abscisic acid dimer가 특이적 대사체로 추출 되었음을 확인하였다(Table 1). 이러한 경향은 블루베리의 안토시아닌 추출을 위해서는 methanol이 가장 적절한 용매 라는 Barnes 등(11)의 보고와 일치하는 결과였다.
- 본 연구에 사용한 각 추출 분획에 존재하는 특징적인 대사체들의 발굴과 동정을 위해서 다변량 통계분석을 실시하여 유의적 차이를 보이는 대사체를 선발하고 이들에 대한 동정을 실시하였다. Principal component analysis(PCA) 결과 ethyl acetate 분획과 methanol 분획에 함유된 대사체들은 positive ion mode에서는 주성분1 62.2%, 주성분2 25.2%의 변이에 의해 유의적인 차이를 나타냄을 확인할 수 있었다(Fig. 2). Negative ion mode에서 검출된 대사체들의 경우는 positive ion mode와 다르게 대사체들 간 변이의 92.
- 3, Table 1). 동정 결과 positiveion mode에서는 5-O-feruloylquinic acid, malvidin hexoside, malvidin-3-arabinoside, petunidin-3-arabi-noside, delphinidin 등의 대사체들이 methanol 분획에 존재하는 특이적인 화합물들로 나타났고, ethyl acetate 분획에는 chlorogenic acid, 6,8-di-C-arabinopyranosyl-luteolin, luteolin이 동정되었다(Table 1). Negative ion mode에서는 5-O-feruloylquinic acid, delphinidin hexoside, petunidin hexoside와 같이 주로 안토시아닌 계열의 화합물들이 존재하였고, ethyl acetate 분획에서는 플라보노이드 계열의 화합물들인 chlorogenic acid, chlorogenic acid dimer, abscisic acid dimer가 특이적 대사체로 추출 되었음을 확인하였다(Table 1).
- 2분에 chlorogenic acid가 positive ion mode와 동일하게 크게 검출되었고, 그 외에 feruloylquinic acid와 quercetin의 유도체 등 다양한 플라보노이드 화합물들이 검출되었다. 반면 methanol 분획에서는 positive ion mode에서와는 다르게 quercetin, ferulic acid, isorhamnetin 등과 같은 플라보노이드 계통의 화합물들과 함께 delphinidin이 검출되어, ethyl acetate 분획에 비해 좀 더 다양한 대사체들로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다. Kader 등(16)은 블루베리에 함유된 페놀성 화합물의 동정을 위해 다양한 추출 조건과 분석 조건의 설정에 따른 주요 화합물의 분석을 실시한 바 있다.
- 블루베리에는 다양한 종류의 안토시아닌 성분이 존재하는 것으로 보고되고 있고, 이러한 특성은 berry류 내의 과실 중에서도 매우 특징적인 조성으로 알려져 있다(1,11). 본 연구에 사용된 methanol 분획에는 기존 보고들과 같이 다양한 종류의 안토시아닌과 배당체가 존재함을 확인할 수 있었고, ethyl acetate 분획과의 확연한 조성의 차이를 볼 수 있었다.
후속연구
- LC-MS/MS에서 검출되는 대사체를 통계 처리한 결과, methanol 추출 분획에서는 5-O-feruloylquinic acid, malvidin hexoside, malvidin-3-arabinoside, petunidin-3-arabinoside, delphinidin hexoside, delphinidin, petunidin hexoside와 같은 안토시아닌 계열의 화합물들이 존재하였고, ethyl acetate 분획에서는 chlorogenic acid, chlorogenic acid dimer, 6,8-di-C-arabinopyranosylluteolin, luteolin과 같은 플라보노이드 계열의 화합물이 검출되었다. 본 연구는 기존 연구와 달리 대사체학 기법을 이용한 블루베리 추출물 전체 대사물질의 profiling을 시도한 최초의 연구로서 블루베리에 함유된 유용 성분의 스크리닝등 향후 응용 연구에 유용한 기반으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 또한 폴리페놀류와 관련해서는 Azar 등(15)에 의해서 12종류의 폴리페놀류와 이들의 배당체들이 보고되었고, 다양한 종의 블루베리에 함유된 폴리페놀류들에 대한 연구가 진행된 바 있다(16). 이상과 같은 블루베리에 함유된 유용 화합물들에 대한 분석은 다양한 크로마토그래피 분석 기술의 발전과 함께 지속적으로 발전해 오고 있으나, 물질의 동정에 사용할 표준화합물이 없는 문제로 전체적인 대사체의 규명에는 한계를 보이고 있다. 최근에는 기존에 사용되어 오던 UV-vis 혹은 photodiode array(PDA) 검출기의 한계를 보완할 수있는 질량분석기(mass spectrometer, MS)를 도입하여 좀 더 정확한 물질의 분석이 가능하게 되었으나, 다양한 화합물들의 정확한 구조 분석에는 여전히 한계점을 보이고 있다.
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