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문제 정의
- 우리나라의 식품의약품안전처에서는 미국의 FDA과 유럽연합의 ISO 기준인 막여과법과 함께 희석중화법(Dilution-neutralization method)을 시험법으로 한 새로운 가이드라인을 제시할 예정이다. 이에 본 연구에서는 막여과법과 희석중화법의 살균력 검사 결과를 비교하고 시판되고 있는 콘택트렌즈 관리용품의 살균력을 제시하고자 한다.
- 본 연구에서는 FDA와 ISO의 콘택트렌즈 살균력 검사방법인 막여과법과 식품의약품안전처에서 살균력검사법으로 새롭게 가이드라인을 제시하려고 하는 희석중화법의 살균력을 비교해보고 시판되고 있는 콘택트렌즈 관리용품의 살균력을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 소독성분 원료 용액과 콘택트렌즈 관리용액을 10 ml에 각각 1.0 × 105 cfu/ml로 희석된 1.0 ml의 균을 넣어 잘 섞은 후 제조사의 살균 시간으로 권장하고 있는 시간의 25%, 50%, 75%, 100% 동안 균주를 관리용품에 노출시켰다.
- 균 배양시 포도상구균, 녹농균, 세라티아균은 Tryptone Soya Agar(TSA)배지, 칸디다균의 경우 Yeast Malt Agar(YMA)배지를 사용하였고 계대배양은 5번을 초과하지 않았다. 살균력 검사를 위해서 35~37oC의 온도에서 18~24시간동안 배양하였으며 적절한 균 수로 배양한 후 살균력검사에 사용하였다.
- 콘택트렌즈 관리용품에서 살균제로 사용되는 과산화수소와 포비돈을 대상으로 막여과법과 희석중화법의 살균력 평가를 하였다. 3% 과산화수소 및 포비돈이 함유된 관리용품의 적용시간이 모두 4시간이었기에 FDA 및 ISO 기준과 동일하게 1시간(25%), 2시간(50%), 3시간(75%), 4시간(100%)동안 균에 살균제를 적용시킨 후 균 수를 측정하였다.
- 콘택트렌즈 관리용품에서 살균제로 사용되는 과산화수소와 포비돈을 대상으로 막여과법과 희석중화법의 살균력 평가를 하였다. 3% 과산화수소 및 포비돈이 함유된 관리용품의 적용시간이 모두 4시간이었기에 FDA 및 ISO 기준과 동일하게 1시간(25%), 2시간(50%), 3시간(75%), 4시간(100%)동안 균에 살균제를 적용시킨 후 균 수를 측정하였다.
- 각기 상이한 살균성분을 함유하고 있는 3종의 관리용품의 살균력을 막여과법과 희석중화법으로 평가하여 보았다. 막여과법으로 살균력을 평가할 때 폴리콰테리움 성분이 포함된 R 용액은 녹농균, 포도상구균, 세라티아균에서는 살균력의 측정이 가능하였지만 칸디다균은 막에 균들이 뭉쳐있어 콜로니 수의 측정이 불가능하였다.
- 최소 권장 살균시간이 5분인 A제품의 경우는 막여과법에서 용액에 노출된 균을 막 필터에 걸러 배지에 밀착시키는 과정과 희석중화법에서 균을 도말하는 과정에 일정 시간이 소요되기 때문에 100% 이하에 해당하는 시간의 적용은 불가능하여 제조사 최소권장기준 시간의 100%, 200%, 400%에서 실험을 실시하였고 100%에 해당하는 시간부터 콜로니수가 0.0±0.0 cfu/plate이였다(Table 5).
- 0 × 104 cfu/ml의 희석균 1 ml를 넣고 13,500 rpm으로 1분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 침전물 상태의 균에 1 ml의 콘택트렌즈 다목적용액과 원액을 넣어 잘 섞어 주어 제조사의 살균시간으로 권장하고 있는 시간의 25%, 50%, 75%, 100% 시간 동안 관리용품에 노출시킨 후 다시 13,500 rpm으로 원심분리 하였다. 다시 상층액을 제거하고 침전물 상태의 균에 PBS 희석액 1 ml을 넣어 잘 섞어 배지에 100 µl를 뿌려 도말한 후 약 35~37oC에서 18~24시간동안 뒤집어서 배양하였다(Table 2).
대상 데이터
- 포도상구균(Staphylococcus aureus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 세라티아균(Serratia marcescens), 칸디다균(Candida albicans)등 4가지 균주를 실험대상으로 하였다.
- 균 배양시 포도상구균, 녹농균, 세라티아균은 Tryptone Soya Agar(TSA)배지, 칸디다균의 경우 Yeast Malt Agar(YMA)배지를 사용하였고 계대배양은 5번을 초과하지 않았다. 살균력 검사를 위해서 35~37oC의 온도에서 18~24시간동안 배양하였으며 적절한 균 수로 배양한 후 살균력검사에 사용하였다.
- 콘택트렌즈 관리용품의 살균성분으로 사용되고 있으며 시중에서 원료구입이 가능한 포비돈(Povidone)과 과산화수소(Hydrogen peroxide)를 관리용품 구성 농도인 각각 0.4%와 3%의 용액을 만들어 사용하였다. 콘택트렌즈 관리용품은 구성성분의 종류와 성분농도에 따라 20종을 선정하여 실험 대상으로 하였다(Table 1).
- 4%와 3%의 용액을 만들어 사용하였다. 콘택트렌즈 관리용품은 구성성분의 종류와 성분농도에 따라 20종을 선정하여 실험 대상으로 하였다(Table 1).
이론/모형
- 1. Disinfection efficacy of disinfectants and lens care products against Staphylococcus aureus evaluated by membrane filtration and dilution-neutralization method.
- 2. Disinfection efficacy of lens care products containing disinfectants besides PHMB against Pseudomonas aeruginosa evaluated by dilution-neutralization method.
- 3. Disinfection efficacy of lens care products containing disinfectants besides PHMB against Staphylococcus aureus evaluated by dilution-neutralization method.
- 4. Disinfection efficacy of lens care products containing disinfectants besides PHMB against Serratia marcescens evaluated by dilution-neutralization method.
- 5. Disinfection efficacy of lens care products containing disinfectants besides PHMB against Candida albicans evaluated by dilution-neutralization method.
성능/효과
- [1] 황색포도상구균은 호기성 혹은 통성혐기성 그람양성세균으로 사람의 피부나 점막에 집락을 형성하고 높은 보균율로 인하여 인체에 매우 흔한 감염증을 일으키며[2] 각막 상피세포의 염증반응을 촉진한다는 연구 결과에 따라 염증질환에 중요한 병원인자로 추정되었다.[3,4] 균 중에 특히 문제가 되고 있는 녹농균은 소프트콘택트렌즈 착용자에서 잘 감염되며 점안약을 통해서도 감염되는 균주로 감염되면 급속히 각막을 천공시켜 여러 합병증을 일으킨다.
- 녹농균의 경우 25% 시간 동안 포비돈을 적용시켰을 때 콜로니수가 평균 2.0±1.0 cfu/plate였으며 반응시간이 50% 시간 이상이었을 때는 콜로니가 관찰되지 않아 완벽한 살균력을 보임을 알 수 있었다.
- 반면 희석중화법으로 평가하였을 때는 모든 균의 살균력 평가가 가능하여 칸디다균에 25% 시간 적용시에 106.0±2.8 cfu/plate, 100% 시간 일 때 56.5±2.1 cfu/plate로 적용시간이 증가할수록 콜로니 수가 감소함을 평가할 수 있었다.
- 포비돈의 적용시간이 증가할수록 세라티아균의 콜로니 수가 감소하였으나 100% 시간 동안 적용 시에도 콜로니 수가 평균 22.5±17.7 cfu/plate로 완전한 살균력을 보이지는 않았다.
- 포도상구균은 포비돈을 25%시간 동안 적용시켰을 때 콜로니 수가 147.0±22.6 cfu/plate였으며 반응시간이 50% 시간에서는 54.3±11.0 cfu/plate, 100% 시간이 지나도 14.5±0.7 cfu/plate로 일정한 수 이상의 콜로니가 관찰되어 완벽한 살균력을 보이지는 않음을 확인할 수 있었다.
- 막여과법을 이용하여 살균력을 평가하여 보았을 때 살균력이 강한 3% 과산화수소를 각 시간 동안 녹농균, 포도상구균, 세라티아균, 칸디다균에 적용시켰을 때 모든 시간대에 균들이 사멸되는 것이 관찰되었으나 살균력이 약한 0.4% 포비돈의 경우는 100% 시간 동안 적용 시에도 모든 종의 균들에 대해 살균효과가 적어 콜로니 수를 셀 수 없을 정도로 균이 뭉쳐있고 수가 많아 살균효과 값의 제시가 불가능하였다(Table 3, Fig. 1).
- 희석중화법과 마찬가지로 살균력이 강한 3% 과산화수소를 적용하였을 때는 모든 시간대에서 녹농균, 포도상구균, 세라티아균, 칸디다균이 모두 사멸되었다. 살균력이 약한 포비돈의 경우 살균력 값의 제시가 어려웠던 막여과법과는 달리 희석중화법을 이용하여 살균력을 측정하였을 때는 가장 반응시간이 적은 25% 시간 동안 노출하였을 때 조차도 균수의 측정이 가능해 적절한 살균력 값의 제시가 가능하였다.
- 각기 상이한 살균성분을 함유하고 있는 3종의 관리용품의 살균력을 막여과법과 희석중화법으로 평가하여 보았다. 막여과법으로 살균력을 평가할 때 폴리콰테리움 성분이 포함된 R 용액은 녹농균, 포도상구균, 세라티아균에서는 살균력의 측정이 가능하였지만 칸디다균은 막에 균들이 뭉쳐있어 콜로니 수의 측정이 불가능하였다. 반면 희석중화법으로 평가하였을 때는 모든 균의 살균력 평가가 가능하여 칸디다균에 25% 시간 적용시에 106.
- 1 cfu/plate로 적용시간이 증가할수록 콜로니 수가 감소함을 평가할 수 있었다. PHMB가 함유된 F 용액을 막여과법으로 평가하였을 때 녹농균, 포도상구균, 세라티아균의 경우는 살균력의 평가가 가능하였으나 칸디다균에 25% 및 50% 시간동안 적용하였을 때 콜로니 수의 측정이 불가능하였고, 희석중화법으로 평가하였을 때는 모든 균에서 살균력 평가가 가능함을 확인할 수 있었다. 글루코산클로로헥시딘(Chlorhexidine gluconate)이 포함된 W 용액의 경우 살균력이 비교적 우수하여 막여과법과 희석중화법 모두 100%시간일 때 완벽한 살균력을 나타냈으며 살균력의 평가가 쉽게 이루어졌다(Table 3).
- PHMB가 함유된 F 용액을 막여과법으로 평가하였을 때 녹농균, 포도상구균, 세라티아균의 경우는 살균력의 평가가 가능하였으나 칸디다균에 25% 및 50% 시간동안 적용하였을 때 콜로니 수의 측정이 불가능하였고, 희석중화법으로 평가하였을 때는 모든 균에서 살균력 평가가 가능함을 확인할 수 있었다. 글루코산클로로헥시딘(Chlorhexidine gluconate)이 포함된 W 용액의 경우 살균력이 비교적 우수하여 막여과법과 희석중화법 모두 100%시간일 때 완벽한 살균력을 나타냈으며 살균력의 평가가 쉽게 이루어졌다(Table 3).
- 막여과법의 경우 균을 배양한 시간은 3일이지만 희석중화법의 경우 18~24시간으로 빠른 시간 내에 생균수를 측정하여 살균력을 평가 할 수 있으며 샘플의 경우 10 ml 이상 필요로 하는 막여과법과 비교하였을 때 1 ml의 소량의 샘플 양으로 실험이 가능하였다. 또한 살균력이 약한 샘플의 생균 측정 시 막여과법은 균들이 뭉쳐 자라 정확한 결과 확인이 어려웠지만 희석중화법은 정확한 균수를 확인할 수 있었다. 막 홀더를 이용하여 균을 필터에 걸러내야 하는 막여과법은 홀더에 균이 오염될 수 있는 문제점 또한 가지고 있다(Table 4).
- 따라서 본 연구를 통한 콘택트렌즈 관리용품의 인허가 과정 중에 요구되는 살균력 평가 기준시험으로 희석중화법의 적절하다는 평가 결과는 제조사가 살균력 평가에 막여과법과 함께 좀 더 간편하게 살균력 평가가 가능한 희석중화법을 적용할 수 있는 근거를 제공하였다는 점에서 큰 의의를 가지는 것으로 생각된다.
- 20% PHMB가 함유되어 있는 R제품의 경우 100% 적용시에도 칸디다 콜로니 수가 56.5±2.1 cfu/plate였으며 O제품, Ap제품, W제품, G제품의 경우는 50%에 해당하는 시간부터 완벽한 살균력을 보임을 확인 할 수 있었다.
- M제품의 경우 시간이 증가함에 따라 칸디다 콜로니 수가 꾸준히 감소하였고 A 제품, W 제품, Ap 제품은 25%에 해당하는 시간부터 완벽한 살균력을 보였으나(Table 6) N제품의 경우는 100%에 해당하는 시간에도 칸디다 콜로니 수가 319.3±52.2 cfu/plate로 칸디다 균에 대한 살균력이 약함을 알 수 있었다(Fig. 5).
- 포비돈을 주성분으로 한 N제품의 경우 25%에서는 115.0±32.5 cfu/plate이였고 100%시간에서는 4.0±2.8 cfu/plate으로 시간이 지남에 따라 세라티아균의 콜로니 수가 줄어든 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 4).
- N제품의 경우 제조사 최소권장기준 시간의 25% 시간에서 콜로니수가 156.0±9.9 cfu/plate로 다른 관리용품에 비해 포도상구균에 대한 살균력이 크게 떨어졌으며 적용시간이 증가할수록 살균력이 증가하였으나 100% 시간에서도 콜로니수가 0.0±0.0 cfu/plate이 되지 않는 살균력을 나타냈다.
- 포비돈을 주 살균성분으로 포함한 N제품의 경우 제조사 최소권장기준 시간의 25% 시간에서 녹농균 콜로니수가 65.0±4.2 cfu/plate로 다른 관리용품의 0.0±0.0 cfu/plate에 비해 살균력이 크게 떨어졌으며 적용시간이 증가할수록 생존 콜로니수가 감소하여 살균력이 증가가 확인되었으나 FDA와 ISO의 살균력 기준인 99.9%보다 낮은 감소율로 살균력 평가 기준을 통과하지 못하였다(Fig. 2).
- Yeast인 칸디다의 경우 주성분이 20% PHMB인 제품 중 S제품, H제품, Hi제품, D제품, Rg 제품, Ds제품, B제품의 경우 50%에 해당하는 시간부터 완전한 살균력을 보였으며 주성분이 20% PHMB 인 제품 중 F제품과 C제품은 25%에 해당하는 시간부터 50%에 해당하는 시간 사이에 콜로니수가 감소하는걸 보였으나 50% 시간대 이후로는 적용시간이 증가하더라도 살균력의 증가가 나타나지 않았다. M제품의 경우 시간이 증가함에 따라 칸디다 콜로니 수가 꾸준히 감소하였고 A 제품, W 제품, Ap 제품은 25%에 해당하는 시간부터 완벽한 살균력을 보였으나(Table 6) N제품의 경우는 100%에 해당하는 시간에도 칸디다 콜로니 수가 319.
- 0 log의 감소를 보여야 한다. 본 연구에서 박테리아인 녹농균은 포비돈을 주성분으로 한 A제품을 제외한 모든 용액에서 99.9% 이상의 감소를 보여 살균력 평가 기준을 통과하여 시판되고 있는 콘택트렌즈 관리용품은 녹농균에 대해서는 대부분 우수한 살균력을 가지고 있음을 알 수 있었다. 포도상구균, 세라티아균 역시 포비돈을 주 살균 성분으로 한 N제품을 제외한 모든 용액에서 99.
- 9% 이상의 감소를 보여 살균력 평가 기준을 통과하여 시판되고 있는 콘택트렌즈 관리용품은 녹농균에 대해서는 대부분 우수한 살균력을 가지고 있음을 알 수 있었다. 포도상구균, 세라티아균 역시 포비돈을 주 살균 성분으로 한 N제품을 제외한 모든 용액에서 99.9%이상의 감소를 보여 살균력 평가 기준을 통과하였다.
- 0 log의 감소를 보여야 하므로 yeast인 칸디다균의 경우는 박테리아에 비해 비교적 약한 살균력 기준을 가지고 있다. 본 연구의 칸디다균에 대한 살균력 평가에서 16개의 시판되고 있는 콘택트렌즈 관리용품은 90% 이상의 감소를 보여 살균력 평가 기준을 통과하였으나 F제품, C제품, R제품, A제품, N제품 5개 제품은 기준을 통과하지 못하여 시판되고 있는 관리용품 중에는 살균력 기준을 통과하지 못한 제품이 상당 수 존재함을 확인할 수 있었다.
- 실제로 Bullock 등의 연구에서는 지속적인 고온에 의해 콘택트렌즈용액의 진균에 대한 살균력의 감소가 2006년에 발생한 푸사리움(Fusarium)에 의한 유행성 각막염의 원인이라고 하였으며,[13] Ide 등은 ISO의 stand-alone 시험법의 살균력 기준에 적합하거나 기준보다 우수한 살균력을 보이더라도 다목적용액의 진균에 대한 살균력이 불충분하다고 하였다.[14] FDA나 ISO 살균력 기준을 통과하였다 하더라도 소독용 관리용품의 사용목적이나 살균력 평가 기준이 존재하는 모든 균을 100% 살균하는 것이 아니기 때문에 온도나 습도와 같은 주변 환경에 의해 균 개체 수의 증가로 인해 관리용품의 살균력이 충분하지 못한 경우들이 있기 때문에 본 연구에서와 같이 시판 중인 관리용품들이 평가 기준을 통과하지 못할 정도의 살균력을 가지고 있다는 것은 콘택트렌즈 관리의 안전성에 심각한 문제가 초래될 수 있을 것으로 보인다.
- 막여과법의 경우 살균력이 강한 살균성분 및 콘택트렌즈 관리용품의 경우는 균 수의 측정이 용이하였으나 살균력이 약한 경우는 생존 콜로니 수가 많아 콜로니가 뭉쳐 있어 정확한 균 수의 측정이 어려웠으며 시험을 위한 균 배양 시간이 3일로 희석중화법에 비해 오랜 시간이 필요하였다. 반면 희석중화법은 살균력이 약한 경우에도 균이 뭉쳐 자라는 정도가 적어 정확한 균수 측정이 가능하였고 균을 배양하는 시간 또한 1일로 짧은 시간 안에 결과를 확인 할 수 있었으며 막여과법에 사용되는 샘플 양 보다 소량의 샘플로 실험이 가능하였다. 따라서 막여과법과 더불어 희석중화법 또한 콘택트렌즈 관리용품에 대한 살균력측정 시험법으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 보인다.
- 시판되고 있는 소독기능을 가진 콘택트렌즈 관리용품의 살균력 검사에서 시험대상 총 20제품 중 녹농균, 포도상구균, 세라티아균에 대한 FDA 및 ISO 기준을 통과하지 못하는 살균력을 가진 제품은 1종 이었으며, 칸디다균에 대한 기준을 통과하지 못한 제품은 5종으로 관리용품의 제조공정 및 관리 대책이 필요한 것으로 보인다.
- 본 연구 결과 FDA와 ISO에서 살균력 평가의 기준으로 사용하고 있는 막여과법 외에 희석중화법이 콘택트렌즈 관리용품의 살균력 평가에 사용될 수 있음을 알 수 있었다. 막여과법의 경우 균을 배양한 시간은 3일이지만 희석중화법의 경우 18~24시간으로 빠른 시간 내에 생균수를 측정하여 살균력을 평가 할 수 있으며 샘플의 경우 10 ml 이상 필요로 하는 막여과법과 비교하였을 때 1 ml의 소량의 샘플 양으로 실험이 가능하였다.
- 본 연구결과에서 콘택트렌즈 관리용품에 함유되어 성분에 따라 살균력에 차이가 있음을 알 수 있었다. Hume 등[12]의 연구에서 세라티아균의 경우 비구아니드계가 포함된 용액의 살균력이 우수하였다고 하였으며 본 연구에서도 PHMB가 포함된 용액에서 완벽한 살균력을 보이지만 폴리콰테리움이나 알렉시딘(Alexidine) 성분이 함유되어 있는 관리용품은 PHMB가 포함된 용액보다 살균력은 다소 떨어지는 것으로 나타났다.
후속연구
- 반면 희석중화법은 살균력이 약한 경우에도 균이 뭉쳐 자라는 정도가 적어 정확한 균수 측정이 가능하였고 균을 배양하는 시간 또한 1일로 짧은 시간 안에 결과를 확인 할 수 있었으며 막여과법에 사용되는 샘플 양 보다 소량의 샘플로 실험이 가능하였다. 따라서 막여과법과 더불어 희석중화법 또한 콘택트렌즈 관리용품에 대한 살균력측정 시험법으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 보인다.
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