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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 한방소재인 황칠나무, 산수유, 구기자를 이용하여 항산화 및 항노화 효능이 있는 기능성 화장품 소재를 위한 in vitro 실험을 적용하였으며 긍정적인 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 황칠나무, 산수유, 구기자 복합 에탄올 추출물의 주름예방효능에 대해 분석하기 위해 elastase 저해 활성을 조사하였다. 그 결과 에탄올 추출물 100ppm/㎖에서 35.
- 특히, 효소에 의한 방어기전은 catalase (CAT)와 superoxide dismutase (SOD) 등을 대표적으로 들 수 있다. 이에 본 연구에서는 추출물의 항산화 효능을 검증하기 위하여 DPPH 라디칼 소거능과 SOD유사 활성을 관찰하였으며, 추출물의 농도에 비례하여 높은 항산화 효능을 나타내었다. 산화에 의한 피부손상은 다양한 노화 징후 즉 잔주름, 굵은 주름, 색소침착, 피부건조증 등의 증상과 밀접한 관련이 있어 항노화에 있어서 산화에 적극적으로 억제하는 것이 중요하다.
- 그러므로 elastase 저해제는 피부 주름을 개선하는 작용을 하며 urosolic acid 등이 elastase 저해제로 알려져 있다22). 본 연구에서 복합 소재 에탄올 추출물은 elastase 저해 활성을 나타내었으며, 이는 피부의 주름을 개선하는 항노화 기능성소재로서의 가능성을 나타낸다.
- 본 연구는 황칠나무, 산수유, 구기자 복합 에탄올 추출물의 항산화 및 항노화 효능을 조사하였고 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- 45㎕필터에 필터링 후 다시 농도별로 세포배양액 또는 PBS 완충용액에 희석하여 최종 시료로 사용하였다. 복합소재의 비율은 황칠나무 : 산수유 : 구기자를 2 : 3 : 1의 비율로 정하여 추출하였으며 이는 항산화 실험에서 가장 효능이 우수한 것을 기준으로 비율을 선정한 것이다. 추출물에 대한 추출 조건과 in vitro 실험은 최소 3회 이상 반복실험을 수행하였다.
- 복합소재의 비율은 황칠나무 : 산수유 : 구기자를 2 : 3 : 1의 비율로 정하여 추출하였으며 이는 항산화 실험에서 가장 효능이 우수한 것을 기준으로 비율을 선정한 것이다. 추출물에 대한 추출 조건과 in vitro 실험은 최소 3회 이상 반복실험을 수행하였다.
- 피부섬유아세포를 2 × 106개/ 2 ㎖의 세포를 6-well plate에 접종한 뒤 각 well에 추출물 농도별로 첨가하여 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였으며, 이때 MMP-1의 활성을 높이기 위하여 TNF-α를 10 ng/㎖의 농도로 첨가하였다.
- 이 Radical에 의한 소거활성은 지질과산화 억제활성을 비롯한 항산화 활성과 상관관계를 보이므로 항산화제 검색에 널리 이용되고 있다. 추출물의 항산화 활성 측정 (Electron donating abilities, EDA)은 Blois의 방법을 변형하여 측정하게 되는데, 각 시료용액 2.0 ㎖에 0.2 mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 0.5 ㎖를 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517 nm 에서 흡광도를 측정한다.
- 자외선 B 조사로 인한 세포독성 및 산화적 세포사멸에 대한 추출물의 항노화 효과를 확인하기 위해서 UVB를 다음과 같은 조건으로 처리하였다. 이때 HS68 세포를 48-well plate에 4 × 104 cells/well로 분주한 다음 24시간 후에 FBS를 포함하지 않는 배지로 교환하여 24시간 동안 배양하였다.
- 이때 HS68 세포를 48-well plate에 4 × 104 cells/well로 분주한 다음 24시간 후에 FBS를 포함하지 않는 배지로 교환하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 PBS로 washing 하고, 그 후 PBS 200 ㎕를 well에 분주 후 자외선 조사장치 (Ultra-Violet Products Ltd., Upland, CA, USA)를 사용하여 UVB를 120 mJ/cm2로 조사하였다. 자외선 B 조사 후에 PBS를 제거하고 배지로 교환한 후 추출물을 처리한 다음 24시간 후에 변화를 측정하였다.
- , Upland, CA, USA)를 사용하여 UVB를 120 mJ/cm2로 조사하였다. 자외선 B 조사 후에 PBS를 제거하고 배지로 교환한 후 추출물을 처리한 다음 24시간 후에 변화를 측정하였다.
- TRIzol Reagent를 이용하여 total RNA를 추출하였으며 추출한 RNA로 부터 cDNA를 합성하였으며, 효소들의 유전자 발현을 비교 측정하기 위하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 진행한 후 95℃에서 30초, 53-61℃에서 1분, 72℃에서 1분을 40 cycle 진행한 후 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.
- PCR 조건은 95℃에서 5분간 진행한 후 95℃에서 30초, 53-61℃에서 1분, 72℃에서 1분을 40 cycle 진행한 후 72℃에서 5분간 더 반응시켰다. 각 PCR 산물들은 edithium bromide를 포함하고 있는 1.5% agarose gel에서 50 V로 전기영동 한 후 type 1 collagen과 type 1 procollagen 노화관련 유전자 발현을 확인하였다.
- 한방복합 에탄올 추출물의 항산화 활성은 DPPH 라디칼에대한 시료의 환원력으로 측정하였다. DPPH는 보라색을 띠며 화학적으로 안정화된 자유라디칼을 가지고 있는 수용성 물질로 전자를 받게 되면 흡광도가 감소하며, 환원력이 있는 물질과 만나 전자를 내어주면 DPPH 라디칼이 소멸되어 특유의 보라색이 옅은 노란색으로 변하는 것을 측정한다.
- 한방 복합 추출물을 이용하여 세포 독성에 미치지 않는 100ppm으로 세포에 전처리하였으며, 비교군으로서 Vitamin C도 세포독성을 나타내지 않는 0.1ppm으로 전처리하였다. 그 결과 MMP-1활성도를 높이기 위해 처리되었던 TNF-α를 단독으로 처리한 군은 MMP-1 수준이 현저히 증가한 것을 관찰할 수 있었으며, 반면 추출물을 처리한 군에서는 MMP-1수준이 TNF-α 단독 처리군 보다 유의하게 감소되었으며, 이는 추출물이 collagen분해에 영향을 미치는 MMP-1의 활성을 억제함으로써 피부노화 억제에 도움을 줄 수 있음을 의미한다 (Fig.
대상 데이터
- 전라남도 신안군 흑산면에서 자생하는 황칠나무의 줄기, 전라남도 구례군 산동면에서 자생하는 산수유, 전라남도 진도군 의신면에서 자생하는 구기자를 산지에서 구입하여 건조한후 분쇄기 (HMF-502, 한일전기)로 분쇄한 다음 분말을 14mesh 분체를 통과한 것만을 실험재료로 사용하였다. 실험에 사용한 시약은 일급시약을 사용하였다.
- 전라남도 신안군 흑산면에서 자생하는 황칠나무의 줄기, 전라남도 구례군 산동면에서 자생하는 산수유, 전라남도 진도군 의신면에서 자생하는 구기자를 산지에서 구입하여 건조한후 분쇄기 (HMF-502, 한일전기)로 분쇄한 다음 분말을 14mesh 분체를 통과한 것만을 실험재료로 사용하였다. 실험에 사용한 시약은 일급시약을 사용하였다.
- 분쇄한 황칠나무, 산수유, 구기자를 상온에서 80% 에탄올을 용매로 하여 상온에서 추출하여 실험에 이용하였다. 획득한 시료를 1차 농축하고 2차로 동결 건조하여 본 연구에 사용하였다.
- 인간 섬유아세포주인 HS68 (human skin fibroblast) 세포배양을 위한 Dulbecco's modified Eagel's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및 항생제 (penicillin/streptomycin)는 Gibco사 (Grand Island, NY, USA) 제품을 구입하여 사용하였다.
- 인간 섬유아세포주인 HS68 (human skin fibroblast) 세포배양을 위한 Dulbecco's modified Eagel's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및 항생제 (penicillin/streptomycin)는 Gibco사 (Grand Island, NY, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. DMEM에 10% FBS, 100 U/㎖ penicillin 및 100 ㎍/㎖ streptomycin을 혼합한 배지를 사용하였고, 37℃, 5% CO2조건의 incubator에서 배양하였다.
데이터처리
- 결과 통계처리는 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, 평균치간의 유의성은 Student's test를 이용한 후 P값이 0.05미만일 때 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 추출물의 SOD 효소 활성은 SOD assay Kit-WST를 이용하여 지시대로 측정하였음. 96-well plate에 추출물을 넣고 WST-1 (2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4- disulfophenyl)-2H-tetrazolium, mono-sodium salt)과 xanthine oxidase working solution을 첨가한 후 37℃에서 20분간 incubation한 후 microplate reader에서 450 nm 파장을 측정한다.
- E.의 방법에 따라 Matrix Metalloproteinase-1 Biotrack activity Assay Kit (Amersham Bioscience)을 이용하여 plate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 한방복합 에탄올 추출물이 피부섬유아세포 독성에 미치는 영향을 측정한 결과 100ppm에서 세포독성을 나타내지 않았으며, 200ppm이상에서는 세포생존율이 80%대로 감소하였다(Fig. 1). 또한 항산화제로 광범위하게 사용되고 있는 BHT (butylated hydroxy toluene)와 vitamin C를 대조군으로 이용하여 에탄올 추출물의 효능을 비교하였으며 BHT의 세포독성을 MTT assay로 평가한 결과 0.
- 1). 또한 항산화제로 광범위하게 사용되고 있는 BHT (butylated hydroxy toluene)와 vitamin C를 대조군으로 이용하여 에탄올 추출물의 효능을 비교하였으며 BHT의 세포독성을 MTT assay로 평가한 결과 0.1ppm에서는 독성을 나타내지 않았으며 0.3ppm부터 50%이하의 세포생존율을 나타내었다. Vitamin C는 0.
- 그 결과 MMP-1활성도를 높이기 위해 처리되었던 TNF-α를 단독으로 처리한 군은 MMP-1 수준이 현저히 증가한 것을 관찰할 수 있었으며, 반면 추출물을 처리한 군에서는 MMP-1수준이 TNF-α 단독 처리군 보다 유의하게 감소되었으며, 이는 추출물이 collagen분해에 영향을 미치는 MMP-1의 활성을 억제함으로써 피부노화 억제에 도움을 줄 수 있음을 의미한다 (Fig. 5).
- DPPH는 보라색을 띠며 화학적으로 안정화된 자유라디칼을 가지고 있는 수용성 물질로 전자를 받게 되면 흡광도가 감소하며, 환원력이 있는 물질과 만나 전자를 내어주면 DPPH 라디칼이 소멸되어 특유의 보라색이 옅은 노란색으로 변하는 것을 측정한다. 이러한 원리를 바탕으로 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과 추출물의경우 농도 의존적으로 DPPH 라디칼에 대한 시료의 환원력이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 2).
- 추출물의 SOD 효소 활성은 SOD assay Kit-WST를 이용하여 지시대로 측정하였으며, 그 결과 한방복합 에탄올 추출물 처리군에서 농도 의존적으로 항산화 효능을 나타남을 알 수 있었다 (Fig. 3).
- 즉, 피부의 주름은 콜라겐의 합성과 분해의 불균형에 기인하며 특히 광노화된 피부의 경우 콜라겐 합성이 감소하고 분해효소의 활성이 증가되어 있는 특성이 나타난다. 본 실험에서 HS68 세포에 자외선 B를 노출시킨 경우 type Ⅰ collagen 및 type Ⅰ procollagen의 mRNA 합성이 현저히 감소되었으나, 추출물을 처리 하였을 때 type Ⅰ collagen 및 type Ⅰ procollagen의 mRNA 합성이 증가한 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 4). 광노화에 의한 collagen의 감소는 깊은 주름과 같이 피부노화징후와 직접적으로 연관이 있고 할수 있다.
- 그 결과 에탄올 추출물 100ppm/㎖에서 35.2±5.7의 저해 활성을 나타났으며 vitamin C보다는 낮은 활성을 나타내었으나 농도가 1000배 차이 나므로 에탄올 추출물이 농도에 비례하여 우수한 효능을 나타냄을 알 수 있었다 (Table 1).
- 본 연구에서는 항노화 소재로서 황칠나무, 산수유, 구기자 복합 소재를 에탄올 추출하여 MMP-1활성 저해활성을 평가한 결과 TNF-α를 단독으로 처리한 군보다 MMP-1의 활성이 약25% 감소된 것을 확인하였으며, 이는 항노화 관련 화장품이나 건강기능성 식품에 적용되기에 적절하다고 사료된다.
- 복합 생물소재 3종 (황칠나무, 산수유, 구기자)을 이용한 에탄올 추출물의 항산화 및 세포독성, 항노화 (Type Ⅰ Collagen), MMP-1 저해활성, Elastase 저해활성 등에 대한 효력시험을 수행한 결과 전체적으로 농도 의존적으로 활성이 나타남을 알 수 있었으며, 이는 대조군인 Vitamin C보다 활성은 높지 않으나 농도 비례 평가하였을 시 우수한 것으로 나타난다. 추후 본 결과를 적극적인 활용을 위하여 식품의약품안전청의 “기능성화장품의 유효성 평가를 위한 가이드라인”에 따라 수행되었으므로 화장품 원료로서의 사용 가치가 높다고 사료된다.
- 1. 추출물은 피부섬유아세포에서 높은 안전성을 나타내었으며, 농도 의존적으로 DPPH radical scavenging activity와 SOD-like activity가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.
- 3. 추출물을 처리한 군에서는 MMP-1 수준이 TNF-α 단독 처리군 보다 감소되었으며, elastase 저해활성 측정에서도 농도에 비례하여 우수한 효능을 나타냄을 알 수있었다.
- 2. HS68 세포에 자외선 B를 노출시킨 경우 type Ⅰ collagen 및 type Ⅰ procollagen의 mRNA 합성이 현저히 감소되었으나, 추출물을 처리 하였을 때 type Ⅰ collagen 및 type Ⅰ procollagen의 mRNA 합성이 증가한 것을 관찰할 수 있었다.
후속연구
- 추후 본 결과를 적극적인 활용을 위하여 식품의약품안전청의 “기능성화장품의 유효성 평가를 위한 가이드라인”에 따라 수행되었으므로 화장품 원료로서의 사용 가치가 높다고 사료된다.
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