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문제 정의
- succinogenes. R. albus와 R. flavefaciens를 대상으로 반추위에서 볏짚의 소화 과정에 따른 볏짚의 표면 부착 박테리아의 군집 변화를 RT-PCR 기법을 이용 관찰하였으며, 볏짚의 가성소다 처리 농도에 따른 볏짚의 소화와 부착 박테리아의 변화를 모니터링 하고자 실시하였다.
- ,(1991)과 Flint and Forsberg(1995)는 조사료의 소화가 이루어지기 위해서는 미생물 부착이 반드시 필요하다는 것을 전제조건으로 제시한 바 있다. 따라서 본 연구는 볏짚을 사용하여 반추위내 발효에 따른 부착 미생물의 군집 변화를 관찰하기 위하여 실시하였다.
- 따라서 본 연구는 우리나라 대표적 조사료인 볏짚의 소화 과정에 따른 볏짚 표면에 부착하는 반추위 섬유소 분해박테리아의 군집변화를 관측하기 위하여 반추위 주요 섬유소 분해 박테리아인 F. succinogenes. R.
- 본 연구는 조사료의 반추위 발효가 진행됨에 따른 볏짚 표면에 부착된 섬유소 분해 박테리아의 군집변화와 섬유소 소화율을 비교 관측하기 위하여 볏짚의 in situ 반추 발효를 실시하였다. 그리고 부착 박테리아의 군집 변화를 측정하기 위하여 RT-PCR 기법을 이용하여 F.
제안 방법
- Cheng and Costerton(1980) 그리고 McAllister et al.(1994)은 반추위내 서식하고 있는 박테리아는 크게 5가지로1) 반추위액에 부유되어 있는 박테리아, 2) 사료입자에 약하게 붙어있는 박테리아, 3) 사료입자에 강하게 붙어있는 박테리아, 4) 반추위 상피세포에 존재하는 박테리아, 5) 프로토조아와 곰팡이 표면에 붙어있는 박테리아로 구분하였다. 사료 입자에 부착한 박테리아는 반추위내 미생물에 의한 ATP 생산량의 75%를 담당하고 있으며, 전체 효소중 약 88~91%의 endoglucanase와 xylanase, 75%의 단백질 분해효소를 분비한다고 보고된 바 있다(Minato et al.
- 각 섬유소 박테리아의 정량은 16S rDNA의 copy No의 log값(Log copy No)으로 표기하였으며, 이 값은 control plasmid를 사용하여 만들어진 표준곡선으로부터 계산하였다. Control plasmid는 pGEM-T 와 pGEM-T Easy Vector System(Promega, USA)를 사용하여 메뉴얼에 따라 각각 섬유소 박테리아의 species-specific primer로 증폭한 specific 16S rDNA 절편을 삽입하여 만들었다. 그리고 각 균주에 대한 표준곡선은 control plasmid의 희석 배수에 따른 threshold cycle(Ct) 값과의 상관관계에 의해 만들어졌다.
- In situ 소화율 시험은 nylon bag technicque(Mehrez and Orskov, 1977)을 개량하여 100 mesh(0.149 mm) 나일론 천을 9 × 15 cm 크기로 제작한 nylon bag에 4.0g 정도의 시료를 넣고 입구를 봉하여 준비하였다.
- succinogenes. R. albus와 R. flavefaciens의 군집을 모니터링 하였다.
- (2001)의 방법을 개량한 94℃에서 30초 동안 변성(denaturation), 60℃에서 30초 동안 결합(annealing), 72℃에서 30초 동안 신장(extension) 순으로 48 cycles 실시하였고, 최초 cycle에서는 9분 동안 denaturation, 마지막 cycle에서는 10분 동안 extension시켰다. 각 섬유소 박테리아의 정량은 16S rDNA의 copy No의 log값(Log copy No)으로 표기하였으며, 이 값은 control plasmid를 사용하여 만들어진 표준곡선으로부터 계산하였다. Control plasmid는 pGEM-T 와 pGEM-T Easy Vector System(Promega, USA)를 사용하여 메뉴얼에 따라 각각 섬유소 박테리아의 species-specific primer로 증폭한 specific 16S rDNA 절편을 삽입하여 만들었다.
- , USA)에서 초고속도로 2분간 작동 후 2분 동안 얼음에 냉각하는 순으로 2회 반복하여 cell을 파괴하였다. 그리고 Phenol : chloroform : isoamyl alcohol(25:24:1)을 이용하여 단백질을 제거하고 DNA를 추출하였다. 단백질이 제거된 DNA에 ethanol을 부가하여 DNA를 침전시켰으며 4℃에서 10,000 × g로 20분간 원심분리 하여 DNA 침전물을 얻었다.
- 볏짚의 소화 시간에 따른 부착 미생물 군집 변화 및 소화율을 관찰하기 위하여 무처리 볏짚을 사용하였으며, 반 추위로부터 nylon bag 시료는 0, 5, 10, 30, 60분, 그리고 2, 4, 8, 12, 24 시간 배양 후 수거하여 시험에 사용하였다. 그리고 가성소다 처리에 따른 볏짚의 소화율 및 부착 미생물 군집 변화를 관찰하기 위하여 0, 2, 4, 8% NaOH를 처리한 볏짚을 사용하였으며, 반추위로부터 nylon bag 시료는 0, 12, 24시간 배양 후 수거하여 시험에 사용하였다.
- 그리고 수거된 DNA는 진공건조한 후 TE buffer에 다시 용해하여 RNAase A(최종농도 1 mg mL－1)를 첨가하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그리고 마지막으로 Phenol:chloroform:isoamyl alcohol를 사용하여 DNA를 다시 추출하였으며, 추출된 DNA는 UV/ VIS spectrophotometer(Shimadzu, Japan)를 사용하여 농도를 측정하였다.
- albus는 모두 발효 0~1시간 사이에 볏짚 표면에 부착이 80% 이상 완료되어 이후 발효가 계속 진행되는 동안 일정 수준의 군락을 유지하는 것이 발견되 었다. 그리고 반추위내 유입된 조사료의 표면에 초기 부착 과정을 관찰하기 위하여 0, 5, 10, 30 및 60분 간격으로 볏짚의 in situ 샘플을 채취하여 조사하였을 때 F. succinogenes, R. flavefaciens 및 R. albus의 군락 모두 볏짚이 반추위 유입 후 5분 내에 상당량의 수가 부착함을 발견하였다. 또한 조사료의 반추위 발효 용이성에 따른 섬유소 분해 박테리아의 부착 정도를 관찰하기 위하여 0, 2, 4 및 8% NaOH를 처리한 볏짚을 12 및 24시간 in situ 배양 볏짚의 소화율과 부착 박테리아의 군집 변화를 관측하였을 때, 볏짚의 NaOH 처리 농도가 높아짐에 따라 in situ 소화율이 증가하였으며, 동시에 부착된 박테리아 군집의 증가 경향이 F.
- 반추위 박테리아가 섬유소 분해 작용시 조사료 표면에 부착하는 진행 과정을 세부적으로 관찰하기 위하여 발효 초기 단계인 0, 5, 10, 30 및 60분 간격으로 볏짚의 in situ 샘플을 채취하여 조사하였다. 반추위내 in situ 발효 중인 볏짚의 표면에 부착한 F.
- 볏짚 표면에 부착되어 있는 섬유소 분해 박테리아의 군집변화는 Real-time PCR을 이용하여 F. succinogenes, R. flavefaciens과 R. albus의 군집변화를 관찰 하였으며, In situ 소화율은 in situ 실험에서 수거한 각각의 샘플들을 시험에 따라 냉동 건초 후 샘플의 무게를 측정하여 시험 초기 무게(투입 시료량)에서 감소한 량을 측정하여 백분율로 산정하였다.
- 볏짚의 소화 시간에 따른 부착 미생물 군집 변화 및 소화율을 관찰하기 위하여 무처리 볏짚을 사용하였으며, 반 추위로부터 nylon bag 시료는 0, 5, 10, 30, 60분, 그리고 2, 4, 8, 12, 24 시간 배양 후 수거하여 시험에 사용하였다. 그리고 가성소다 처리에 따른 볏짚의 소화율 및 부착 미생물 군집 변화를 관찰하기 위하여 0, 2, 4, 8% NaOH를 처리한 볏짚을 사용하였으며, 반추위로부터 nylon bag 시료는 0, 12, 24시간 배양 후 수거하여 시험에 사용하였다.
- 그리고 준비된 nylon bac 시료는 공시축의 rumen fistula를 통하여 반추위 후부 깊숙이 넣어 시험 목적에 따라 최고 24시간까지 방치하였다. 시간대별 회수한 nylon bag은 흐르는 멸균 증류수에 맑은 물이 나올 때까지 가볍게 세척 후 냉동 건조시켜 측정하였다.
대상 데이터
- In situ 실험을 위하여 반추위에 캐놀라가 설치된 550 kg 거세 홀스타인종을 사용하였고, 섬유소 분해율 평가를 위한 시료는 무처리 볏짚과 2, 4, 8% NaOH를 처리한 볏짚을 사용하였다.
- succinogenes. R. albus와 R. flavefaciens을 사용하였으며, 균주는 39℃ 혐기상태에서 RGC medium(Ogimoto and Imai, 1981)으로 각각 순수 배양되었다.
데이터처리
- 각각 시험을 통해 얻어진 연구 결과는 실험기간동안 누적 정리 되었고, 모든 자료에 대한 통계분석은 SAS(Statistical Analysis System, 1996)의 General Linear Model procedure를 이용하였으며, 처리 평균치 간의 유의성 분석은 Duncan(1955)의 Multiple Range Test에 의거하여 5% 수준에서 검정하였다.
이론/모형
- 5 g을 채취하여 Purdy et al.(1996)의 방법에 따라 추출하였다. 그리고 섬유소분해 박테리아 즉, F.
- 본 연구는 조사료의 반추위 발효가 진행됨에 따른 볏짚 표면에 부착된 섬유소 분해 박테리아의 군집변화와 섬유소 소화율을 비교 관측하기 위하여 볏짚의 in situ 반추 발효를 실시하였다. 그리고 부착 박테리아의 군집 변화를 측정하기 위하여 RT-PCR 기법을 이용하여 F. succinogenes. R.
- 섬유소 박테리아의 순수배양액과 in situ 배양 후 수거한 볏짚에 부착된 박테리아의 DNA 추출은 Reilly와 Attwood(1998)의 방법에 따라 bead-beating 방법으로 다음과 같이 실시하였다. 순수배양액 및 건조된 볏짚 샘플 100 mg을 1.
- 섬유소 박테리아의 순수배양액과 in situ 배양 후 수거한 볏짚의 표면에 부착한 주요 섬유소분해 박테리아(F. succinogenes, R. flavefaciens, R. albuswere)의 정량 분석은 Quantitative real-time PCR을 이용하여 실시되었다(Sung et al., 2007).
성능/효과
- 본 연구를 수행하기 위하여 in situ 볏짚 발효를 0. 2, 4, 8, 12, 24시간 실시하였을 때 반추위내 볏짚의 in situ 분해는 발효 시간이 진행됨에 따라 가속화되어 발효 8~12시간 사이에 최고 분해 속도를 나타내었으나, F. succinogenes, R. flavefaciens과 R. albus는 모두 발효 0~1시간 사이에 볏짚 표면에 부착이 80% 이상 완료되어 이후 발효가 계속 진행되는 동안 일정 수준의 군락을 유지하는 것이 발견되 었다. 그리고 반추위내 유입된 조사료의 표면에 초기 부착 과정을 관찰하기 위하여 0, 5, 10, 30 및 60분 간격으로 볏짚의 in situ 샘플을 채취하여 조사하였을 때 F.
- 5와 같다. F. succinogenes은 Fig. 5의 A에서와 같이 배양 12시간에는 NaOH 처리 농도가 증가함에 따라 부착 군집의 수(Ct값)가 증가하였으며, 4% NaOH 처리 볏짚에서 가장 높게 나타났는데 이러한 동향은 in situ 소화율의 결과와 같은 경향(Fig. 4)을 보여준 것이다. 그러나 24시간의 Ct값은 NaOH 처리 농도가 증가함에 따라 감소 수치를 나타냈다.
- succinogenes의 부착 균수의 동향과 같은 결과이었다. 그러나 배양 24시간의 Ct값은 HaOH 처리 농도에 따른 일정한 경향을 나타나지 않았으나 4% NaOH 처리 볏짚에서 가장 높게 나타났다. 이상의 결과들은 볏짚을 NaOH 처리함에 따라 in situ 소화율이 증가하였으며, 동시에 볏짚 표면에 부착한 섬유소 분해 박테리아(F.
- 85로 낮은 폭으로 증가하였다. 그리고 R. flavefaciens과 R. albus의 경우는 Fig. 3의 B와 C에서와 같이 발효 5분째 각각 Ct값이 6.75와 6.38로 F. succinogenes의 경향과 같이 급격히 증가 하였으며, 이후 발효 60분 동안 적은 폭으로 증가 경향을 나타내었다. 이상의 결과는 반추위 주요 섬유소 박테리아인 F.
- 21%를 나타냈다. 그리고 in situ 샘플의 채취 구간별 시간당 분해 속도(g DM/h)는 Fig. 1의 B와 같이 발효 초기 0~2시간 사이에 0.32를 나타내었으나, 발효 2~4시간 사이에는 0.98로 증가하였으며, 발효 8~12시간 사이에는 최고치(1.95)에 도달하였다.
- 따라서 본 연구결과는 Fig. 2와 함께 반추위내 섬유소 소화과정에서 섬유소 분해 박테리아는 조사료의 반추위 유입 후 5분내 사료 표면 부착이 이루어졌으며, 발효가 진행함에 따라 조사료 표면에 안정된 군락을 형성하였고, 섬유소 분해 작용에 중요 역할을 담당 하였다는 사실을 보여주었다.
- 따라서 본 연구결과는 반추위내 섬유소 발효과정에서 섬유소 분해 박테리아의 부착은 조사료의 반추위 유입 초기에 반드시 이루어지고, 발효 시간이 진행됨에 따라 조사료 표면에 안정된 군락을 형성하며, 섬유소 분해가 가속화된다는 사실을 보여 주었다.
- , 1994). 따라서 본 연구에서 나타난 in situ 소화율 및 부착 섬유소 박테리아의 증가는 볏짚의 NaOH 처리에 의한 볏짚 표면 및 견고한 섬유소 구조의 파괴 효과로 인하여 나타난 결과로 사료된다. 그리고 이러한 처리 효과는 발효 초기에 미생물 부착에 영향을 주어 군락 형성을 용이하게 하며 이러한 현상은 섬유소 분해에 긍정적 영향을 미친다는 것을 시사한다.
- 또한 사료입자에 부착한 박테리아의 수가 많을수록 CMCase와 xylanase의 역가가 높으며 섬유소 소화율이 증가한다고 하였다. 따라서 본 연구의 결과는 선행 연구들과 함께 반추위내 조사료의 소화 작용에 있어 부착 미생물이 중요한 역할을 한다는 것을 더 명확히 입증함과 동시에 조사료의 반추위 유입시 발효 초기단계에서 조사료 입자 표면에 부착하여 군락을 형성함을 발견할 수 있었다.
- 5의 B와 같이 배양 12와 24시간 모두 NaOH 처리 농도가 증가함에 따라 부착 군집의 Ct값이 증가하였다. 또한 R. albus는 Fig. 5의 C와 같이 배양 12시간에는 NaOH 처리 농도 증가에 따라 부착 군집의 Ct값이 증가하였으며, 4% NaOH 처리 볏짚에서 가장 높게 나타났는데 이는 F. succinogenes의 부착 균수의 동향과 같은 결과이었다. 그러나 배양 24시간의 Ct값은 HaOH 처리 농도에 따른 일정한 경향을 나타나지 않았으나 4% NaOH 처리 볏짚에서 가장 높게 나타났다.
- albus의 군락 모두 볏짚이 반추위 유입 후 5분 내에 상당량의 수가 부착함을 발견하였다. 또한 조사료의 반추위 발효 용이성에 따른 섬유소 분해 박테리아의 부착 정도를 관찰하기 위하여 0, 2, 4 및 8% NaOH를 처리한 볏짚을 12 및 24시간 in situ 배양 볏짚의 소화율과 부착 박테리아의 군집 변화를 관측하였을 때, 볏짚의 NaOH 처리 농도가 높아짐에 따라 in situ 소화율이 증가하였으며, 동시에 부착된 박테리아 군집의 증가 경향이 F. succinogenes, R. flavefaciens 및 R. albus의 3균주 모두 배양 12시간에 나타났으나 배양 24시간에서는 각기 다른 양상을 나타냈다.
- 2의 A, B 그리고 C와 같다. 볏짚이 반추위내 in situ 발효가 진행되는 동안 볏짚 표면에 부착된 F. succinogenes의 군집은 Fig. 2의 A에서와 같이 발효 1과 2시간째 각각 Ct 값이 8.85와 9.36으로 급격히 증가 하였으며, 이후 24시간까지 천천히 낮은 폭으로 증가하여 10.70에 도달하였다. R.
- 2010). 본 연구에서도 볏짚에 NaOH를 0, 2, 4 및 8%를 처리하였을 때 in situ 소화율은 배양 12 및 24시간 모두 NaOH 처리 농도가 증가함에 따라 증가하였으며, 4% NaOH 처리 볏짚이 가장 높은 소화율을 나타냈다(Fig. 4).
- succinogenes의 경향과 같이 급격히 증가 하였으며, 이후 발효 60분 동안 적은 폭으로 증가 경향을 나타내었다. 이상의 결과는 반추위 주요 섬유소 박테리아인 F. succinogenes, R. flavefaciens 및 R. albus는 볏짚의 반추위 유입 후 5분 내에 상당량의 수가 볏짚 표면에 부착함을 보여주었다.
- 그러나 배양 24시간의 Ct값은 HaOH 처리 농도에 따른 일정한 경향을 나타나지 않았으나 4% NaOH 처리 볏짚에서 가장 높게 나타났다. 이상의 결과들은 볏짚을 NaOH 처리함에 따라 in situ 소화율이 증가하였으며, 동시에 볏짚 표면에 부착한 섬유소 분해 박테리아(F. succinogenes, R. flavefaciens 및 R. albus)의 수도 증가하였는데 이러한 경향은 12시간 배양물에서 3균주 모두 나타났으나 24시간에서는 각기 다른 특성을 나타냈다.
- 50에 도달하였다. 이상의 결과와 같이 반추위내에서 볏짚의 in situ 분해는 발효가 진행됨에 따라 가속화되어 발효 중기(8~12시간)에 최고의 분해 속도를 보여준 반면, 볏짚의 표면에 부착한 섬유소 분해 박테리아인 F. succinogenes, R. flavefaciens과 R. albus는 발효 초기(0-1시간)에 부착이 80% 이상이 완료 되었으며 발효가 진행되는 동안 일정 수준의 군락을 유지하는 것을 발견할 수 있었다.
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