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문제 정의
- 우리나라의 대표적 자급 조사료인 볏짚은 영양소 함량이 매우 낮고, 세포벽 구성 물질 중 대부분이 분해가 어려운 구조 탄수화물로 반추동물의 소화 및 이용 효율에 한계가 있다(Jackson, 1977; Devendra, 1982). 따라서 본 연구는 반추동물이 볏짚을 소화하는 과정 중에 주요 반추위 섬유소분해 박테리아의 분포를 연구하여 이들 박테리아와 볏짚 소화와의 관계를 연구함으로서 볏짚의 이용효율을 증진시키기 위한 반추위 섬유소 박테리아에 좀 더 접근한 세부적 연구 자료를 제공하고자 실시하였다.
- 반추위내 박테리아 군집 분포 중에서 볏짚 표면 부착 섬유소 분해 박테리아 군집이 볏짚의 분해 과정에서 어떠한 변화가 있는지 관찰하기 위하여 본 시험이 실시되었다. 볏짚의 표면 부착 주요 섬유소 분해 박테리아 즉, F.
- 본 연구는 반추동물이 볏짚을 소화하는 과정 중에 주요 섬유소 분해 박테리아의 분포 변화를 연구하여 반추위내 볏짚이용효율을 증진시키기 위한 진보적 연구 자료를 제공하고자 실시하였다. 본 연구를 수행하기 위하여 분쇄 볏짚을 기질로 사용한 In vitro 반추위 발효를 실시하였으며, 배양 0.
제안 방법
- 본 연구를 수행하기 위하여 분쇄 볏짚을 기질로 사용한 In vitro 반추위 발효를 실시하였으며, 배양 0. 4, 8, 12, 48시간에 볏짚 건물 소화율 및 섬유소 분해 박테리아 균수 변화를 조사하였다. 섬유소 분해 박테리아 균수는 F.
- (2006)의 방법을 응용하여 준비하였다. In vitro 배양을 위한 반추위액은 시험사료를 급여한 홀스테인 수소 3두로부터 각각 수거한 반추위액을 4겹의 cheese cloth로 거른 후 각각 동일량 혼합하여 준비하였으며, 준비된 반추위액과 McDougall Buffer (McDougall, 1948)을 1:4 (v/v)로 혼합하여 In vitro 반추위 발효용 배양액을 제조하였다. 그리고 혼합배양액은 30 ml씩 0.
- succinogenes. R. albus와 R. flavefaciens를 대상으로 Quantitative real-time PCR을 이용하여 16S rDNA의 copy No의 log값(Log copy No)을 측정하였다.
- albus의 species-specific primer는 Ra1281f (5’-CCC TAA AAG CAG TCT TAG TTC G-3’)와 Ra1439r (5’-CCT CCT TGC GGT TAG AAC A-3’)를 사용하였다(Koike and Kobayashi, 2001). Real-time PCR의 조건은 Tajima et al. (2001)의 방법을 개량한 94℃에서 30초 동안 변성(denaturation), 60℃에서 30초 동안 결합 (annealing), 72℃에서 30초 동안 신장(extension) 순으로 48 cycles 실시하였다. 그리고 최초 cycle에서는 9분 동안 denaturation, 마지막 cycle에서는 10분 동안 extension 시켰다.
- 건물 소화율을 측정하기 위하여 분쇄된 볏짚이 들어있는 In vitro 배양물을 0, 4, 8, 12, 24 및 48시간 배양하였으며, In vitro 배양물은 시간대별 각각 3 bottle를 준비하여 3반복으로 실시하였다. 그리고 In vitro 배양 기간 동안 각 시간별 배양물을 수거하여 filter paper (Whatman No.
- 그리고 새로운 환경과 사료의 적응을 위하여 4주간의 적응사양 후에 본 실험의 공시축으로 사용하였다. 공시축은 시험사료를 준비하여 1일 2회(08:00, 20:00)급여하였으며, 시험사료는 농후사료(40%)와 볏짚(60%)을 혼합 급여하였다. 그리고 물은 자유 채식하도록 하였다.
- 건물 소화율을 측정하기 위하여 분쇄된 볏짚이 들어있는 In vitro 배양물을 0, 4, 8, 12, 24 및 48시간 배양하였으며, In vitro 배양물은 시간대별 각각 3 bottle를 준비하여 3반복으로 실시하였다. 그리고 In vitro 배양 기간 동안 각 시간별 배양물을 수거하여 filter paper (Whatman No. 4)을 사용하여 미분해 잔여물을 수집하였다. 그리고 수집된 미분해 잔여 시료는 냉동 건조 후 샘플의 무게를 측정하여 실험 초기 무게 (투입시료량)에서 감소한 양을 측정하여 백분율로 산정하였다.
- 실험 시료는 볏짚의 표면 부착 박테리아 군집 측정을 위하여 In vitro 건물 소화율 측정 후 냉장 보관한 샘플을 사용하였다. 그리고 In vitro 배양액내 부유 박테리아 군집 측정은 In vitro 건물 소화율 측정을 위해 각 시간대별 배양물을 filter paper(Whatman No. 4)을 사용하여 거를 때 통과한 배양물의 일정량을 멸균 용기에 담아 냉동 보관하여 시료로 사용하였다.
- 공시축은 시험사료를 준비하여 1일 2회(08:00, 20:00)급여하였으며, 시험사료는 농후사료(40%)와 볏짚(60%)을 혼합 급여하였다. 그리고 물은 자유 채식하도록 하였다.
- 4)을 사용하여 미분해 잔여물을 수집하였다. 그리고 수집된 미분해 잔여 시료는 냉동 건조 후 샘플의 무게를 측정하여 실험 초기 무게 (투입시료량)에서 감소한 양을 측정하여 백분율로 산정하였다. 또한 측정이 끝난 시료는 미생물 군집 조사를 위하여 4℃에서 냉장 보관 하였다.
- 섬유소 박테리아 군집 조사는 주요 섬유소분해 박테리아 즉, F. succinogenes, R. flavefaciens 및 R. albus를 대상으로 볏짚의 표면 부착 및 배양액내 부유 박테리아를 측정하였다. 실험 시료는 볏짚의 표면 부착 박테리아 군집 측정을 위하여 In vitro 건물 소화율 측정 후 냉장 보관한 샘플을 사용하였다.
- 각 박테리아 군집의 정량은 16S rDNA의 copy No의 log값 (Log copy No)로 표기하였다. 이 값(Log copy No)는 control plasmid를 사용하여 만들어진 표준곡선으로부터 계산하였고, control plasmid는 pGEM-T와 pGEM-T Easy Vector System (Promega, USA)를 사용하여 매뉴얼에 따라 각각 섬유소 박테리아의 species-specific primer로 증폭한 specific 16S rDNA 절편을 삽입하여 만들었다. 그리고 표준곡선은 control plasmid의 희석 배수에 따른 threshold cycle (Ct) 값과의 상관관계에 의하여 만들어졌다.
대상 데이터
- 볏짚은 분세 후 2mm screen에 통과시켰으며, 분세시 발생한 미분 입자를 제거하기 위하여 증류수에 3번 세척 후 실온에 건조하였다. 건조 후 수거된 분쇄 볏짚을 건물 소화율 및 섬유소 박테리아 군집을 조사하기 위한 In vitro 실험용 시료로 사용하였다.
- 공시축으로는 rumen fistula가 장착된 평균체중 550 kg의 홀스테인 수소 3두를 선발하여 전 실험 기간 동안 다른 우군으로부터 분리 관리하였다. 그리고 새로운 환경과 사료의 적응을 위하여 4주간의 적응사양 후에 본 실험의 공시축으로 사용하였다.
- albus를 대상으로 볏짚의 표면 부착 및 배양액내 부유 박테리아를 측정하였다. 실험 시료는 볏짚의 표면 부착 박테리아 군집 측정을 위하여 In vitro 건물 소화율 측정 후 냉장 보관한 샘플을 사용하였다. 그리고 In vitro 배양액내 부유 박테리아 군집 측정은 In vitro 건물 소화율 측정을 위해 각 시간대별 배양물을 filter paper(Whatman No.
데이터처리
- 각각 시험을 통해 얻어진 연구 결과는 실험기간 동안 누적 정리되었고, 모든 자료에 대한 각 시간대별 반복 결과는 측정치의 평균차를 구하여 결과치의 정확성을 확인하였으며, 그래프에 표준편차 바로 표시하였다.
이론/모형
- 5 g씩 채취하여 Purdy et al.(1996)의 방법에 따라 추출하였다. 그리고 섬유소분해 박테리아의 군집 변화를 조사하기 위한 16S-rRNA의 종간 고유 영역을 증폭하기 위하여 F.
- F. succinogenes, R. flavefaciens 및 R. albus의 정량 분석은 Quantitative real-time PCR을 이용하여 실시되었다(Sung et al., 2009). Real-time PCR은 iCycler iQ real-time PCR system(Bio-Rad Inc.
성능/효과
- F. succinogenes, R. flavefaciens 및 R. albus는 배양 시작 즉시 볏짚 표면에 부착이 발생됨을 발견하였으며, 이때 이들의 부착 군집의 비율은 각각 34.5%, 84.4% 및 67.9%로 차지하였다. 그리고 이들 섬유소 분해 박테리아의 볏짚 부착 비율은 모든 균수가 공히 배양 4시간째부터 94.
- F. succinogenes, R. flavefaciens 및 R. albus의 최고 수준의 볏짚 표면 부착 속도는 배양 12시간에 시작되어 배양 24시간에 각각 10.33, 9.28 및 8.30 Log copy No/h/g DM에 도달하였다. 그리고 섬유소 분해 속도는 표면 부착 속도보다 좀 늦은 배양 24시간에 0.
- R. albus의 배양 시작 초기에 신속하게 볏짚 표면 부착이 이루 짐을 발견할 수 있었으며, 이들 부착 균수의 변화는 F. succinogenes와 R. flavefaciens는 배양 12 및 24시간에 정점 수준을 형성하고 그 이후에는 감소하는 유사한 경향을 나타내었으나 R. albus는 배양 24시간에 정점을 형성하는 다른 경향을 나타냈다(Fig. 3, 4 및 5의 A). 그리고 섬유소 박테리아의 In vitro내 군집 분포 중 볏짚 표면 부착 박테리아가 차지하는 비율은 배양 전기(배양 4시간)까지 급증하여 배양액내 부유균보다 더 우세한 군락을 형성하는 특성을 나타내었다.
- 5 Log copy No/g DM으로 낮은 군집을 나타내었다. 그리고 Fig. 3의 B와 같이 볏짚 표면 부착군집의 비율은 배양 초기 34.5%이었으며, 배양 4 및 8시간에 각각 94.7 및 97.3%로 정점을 나타내었고, 배양 24 및 28시간에는 각각 88.5 및 58.9%로 감소 경향을 나타내었다.
- 5 Log copy No/g DM으로 낮은 균수를 나타내었다. 그리고 Fig. 4의 B와 같이 볏짚 표면 부착 군집의 비율은 배양 초기 84.4%를 나타냈으며, 배양 4, 8 및 12시간에 각각 98.5, 98.5 및 98.9%로 최고 수준을 나타내고, 이후 감소하여 배양 48시간에는 37.6%로 낮아지는 경향을 나타내었다.
- 3, 4 및 5의 A). 그리고 섬유소 박테리아의 In vitro내 군집 분포 중 볏짚 표면 부착 박테리아가 차지하는 비율은 배양 전기(배양 4시간)까지 급증하여 배양액내 부유균보다 더 우세한 군락을 형성하는 특성을 나타내었다. 그러나 배양 시간에 따른 부착 군집의 비율의 변화 경향은 초기 부착비율뿐만 아니라 최고 수준을 형성하는 시기 및 이후 감소 현상은 각각의 섬유소 박테리아 종에 따라 다른 경향을 나타내었다(Fig.
- 30 Log copy No/h/g DM에 도달하였다. 그리고 섬유소 분해 속도는 표면 부착 속도보다 좀 늦은 배양 24시간에 0.95% DM/h로 최고 정점에 도달하였다.
- 9%로 차지하였다. 그리고 이들 섬유소 분해 박테리아의 볏짚 부착 비율은 모든 균수가 공히 배양 4시간째부터 94.7% 이상 최고 수준에 이르렀고, 부착 균수는 균종에 따라 각각 배양 12시간 또는 24시간째에 최고 수준을 나타냈다.
- 따라서 본 연구 결과들은 볏짚이 반추위에 유입되면 즉시 섬유소 분해 박테리아의 볏짚 표면 부착이 발생하며, 이들 박테리아는 소화 초기부터 반추위액 부유 박테리아보다 우세한 군집을 형성하며, 이후 부착 박테리아의 증식이 극대화되며, 최고 수준의 군집을 만들면서 볏짚 소화에 기여한다는 것을 명확히 입증한 것으로 사료된다.
- 따라서 본 연구결과는 반추위 발효 진행 과정에서 섬유소 분해 박테리아 총균의 증식에 따라 조사료의 소화가 증가되며, 상당히 많은 섬유소 분해 박테리아들이 조사료 유입과 동시에 표면 부착이 발생하고, 이들 부착 섬유소 분해 박테리아의 활성화가 먼저 진행된 후에 섬유소 분해 활성화가 이루어져야 조사료 소화의 극대화를 가져올 수 있다는 사실을 제시하여 주었다.
- 그리고 미생물 첨가 연구에서도 섬유소 소화율의 증가와 함께 섬유소 박테리아 군집이 더 높은 수준으로 발달하였다(Sung, 2013). 따라서 이상의 결과들은 섬유소 박테리아가 섬유소 분해에 중요한 역할을 담당함을 16S rDNA 탐색 기법을 통해 좀 더 구체적으로 보여주고 있으며, 이들 총 균수 발달 변화와 섬유소의 분해 진행에 밀접한 관계가 있음을 명확히 보여주고 있다.
- 따라서 이상의 실험 결과들은 섬유소 분해 박테리아가 섬유소 분해 과정에서 초기부터 섬유소 입자에 급속도로 부착이 발생하고, 이들 부착 속도의 가소화가 섬유소 분해 속도의 가속화 보다 동시적이면서도 좀 더 빠르게 진행됨을 보여 주었다. 이것은 섬유소 분해 박테리아의 섬유소 입자 표면 부착과 섬유소 소화 사이에 밀접 상관관계가 존재함을 명확히 보여준다고 사료된다.
- 그리고 배양 48시간에는 다소 낮은 섬유소 분해 속도를 나타냈다. 또한 본 연구 결과(Fig. 6과 7)는 볏짚 표면 부착 속도의 정점 형성이 섬유소분해 속도보다 빠르게 진행되었지만, 모두가 배양 24시간 내에 최고 수준에 도달함을 보여 주었다.
- 볏짚 소화의 증가는 배양 4시간까지는 소폭 증가를 보였으나 8시간을 지나며 24시간까지는 점점 큰 폭으로 증가하였고, 그 이후에는 소화율 증가가 점점 둔화되는 경향을 나타냈다. 또한 이상의 결과(Fig 1과 2)는 배양 초기에 섬유소 분해 박테리아의 총 균수 증가와 함께 볏짚의 소화율 증가가 발생하는 현상을 보여주었으며, 이들 총 균수가 최대를 이루는 배양 12-24시간에 볏짚 소화율도 빠르게 큰 폭으로 증가하였고, 이후에는 총 균수의 감소와 함께 소화율의 증가 둔화도 발견되었다.
- albus의 부착 속도는 유사한 증가 경향을 나타내었다. 이들 모든 균주는 배양 0-4시간에 큰 차이로 높아지는 부착 속도를 보였고, 이후에도 점점 높아져서 배양 12시간을 지나 24시간에 가장 높은 부착 속도 즉, F. succinogenes, R. flavefaciens 및 R. albus는 각각 10.33, 9.28 및 8.30 Log copy No/h/g DM에 도달하였다. 그리고 배양 48시간에는 다소 낮은 부착 속도를 나타냈다.
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