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문제 정의
- 위 내용과 같이 아직까지 우리나라 향나무절에 대한 연구는 부분적이거나 형태적인 연구만이 주로 이루어져 있는 상황으로, 본 연구에서는 형태적으로 유사한 한국산 향나무절 분류군들에 대하여 분자계통학적 연구를 수행함으로써 근연분류군 간의 유전적 유연관계 및 지리학적 분포특성을 파악하고자하였다.
제안 방법
- Farjon (2005)은 전 세계 향나무속 52분류군을 대상으로 비늘잎이 없는 노간주나무절(그룹 1)과 바늘잎이 대부분인 향나무절그룹(그룹 2), 비늘잎이 대부분인 향나무절 그룹(그룹 3)으로 나누었다. 한국산 향나무절 식물들인 향나무와 눈향나무, 단천향나무는 그룹 3에 포함되었으며, 섬향나무는 바늘잎이 대부분인 그룹 2에 포함시키면서 섬향나무의 학명을 Juniperus procumbens를 사용하여 별도의 종수준으로 처리하였다.
- DNA 추출을 위해 확보한 재료의 잎을 Silica gel로 건조시켜 사용하였으며, 건조표본을 이용할 경우 가능한 최근에 수집된 표본의 어린잎을 사용하였다. Total genomic DNA는 DNeasy plant mini kit (QIAGEN, Germany)을 이용하여 공급자의 매뉴얼에 따라 추출하였다. 추출한 DNA는1.
- Total genomic DNA는 DNeasy plant mini kit (QIAGEN, Germany)을 이용하여 공급자의 매뉴얼에 따라 추출하였다. 추출한 DNA는1.5% agarose gel로 전기영동하여 추출여부를 확인하였다.
- 본 연구에서 향나무절의 분자계통학적 분석을 위해 엽록체 DNA matK와 psbA-trnH region을 이용하였다.
- 유전자 증폭을 위한 중합효소 연쇄반응은 1 µL의 template DNA가 포함된 100 µL의 PCR reaction solution (10XMG TM Taq-HF buffer 10 µL, 2 mM MG TM dNTP mixture 10 µL, 10 pmol primer 5 µL(X2), MGTM Taq-HF polymerase 1 µL, 증류수)을 이용하였다.
- PCR products는 Montage PCR Cleanup Kit (Millipore, USA)를 이용하여 공급자의 매뉴얼에 따라 정제하였으며, 정제된 PCR products를 cycle sequencing 반응의 주형으로 사용하였다.
- Cycle sequencing 반응은 Big Dye terminator cycle sequencing kit v3.1 (Applied Biosystems, USA)를 사용하였으며, 대상 유전자의 길이가 1kb를 넘는 matK의 경우 구간 내부의 primer를 이용하여 cycle sequencing하였다. 염기서열의 결정은 3730XL automated DNA sequencing system (Applied Biosystems, USA)을 이용하였다.
- 각 유전자의 염기서열은 Sequencher (ver. 4.5, Gene Codes Co. USA)를 이용하여 조합하였다. 염기서열의 분석을 위하여 직접 염기서열을 정렬하였다.
- USA)를 이용하여 조합하였다. 염기서열의 분석을 위하여 직접 염기서열을 정렬하였다.
- 계통수 구축은 PAUP program (ver. 4.0b10, Swofford, 2002)을 이용하였으며, 형질에 있어서 가중치는 모두 동일하게 처리하였고, 전체 염기서열 중 gap은 모두 결여형질(missing character)로 처리하였으며, 정렬된 염기서열의 모든 형질은 ‘unordered’, ‘unweighted’ character로 설정하였다.
- Maximum likelihood analysis는 GTR + I + Γ 모델을 적용하여 RA×ML BlackBox(http://phylobench.vital-it.ch/raxml-bb/)를 이용하였고, Bootstrap value는 위에 제시된 최대절약분석 방법을 통해 산출하였다.
- PAUP에 의해 가장 짧은 경로를 가지는 계통수를 산출하기 위해 exhaustive search를 통해 최대절약분석 (maximum parsimony analysis)을 실시하였으며, 이에 따른 option으로는 ACTRAN, ‘TBR’ branch swapping, ‘MULPARS’로 최적화하였다.
- PAUP에 의해 가장 짧은 경로를 가지는 계통수를 산출하기 위해 exhaustive search를 통해 최대절약분석 (maximum parsimony analysis)을 실시하였으며, 이에 따른 option으로는 ACTRAN, ‘TBR’ branch swapping, ‘MULPARS’로 최적화하였다. 계통수에서 각 절에 대한 신뢰도를 산출하기 위해서 2개 이상의 tree가 도출된 유전자의 경우 strict consensus tree(완전일치계통수)를 구한 후, Bootstrap 분석(Felsenstein, 1985)을 1,000회 반복하여 bootstrap value를 산출하였다. 또한, matK와 psbA-trnH region에 대한 계통수뿐만 아니라 두 유전자의 염기서열을 조합한 계통수도 함께 작성하였다.
- 계통수에서 각 절에 대한 신뢰도를 산출하기 위해서 2개 이상의 tree가 도출된 유전자의 경우 strict consensus tree(완전일치계통수)를 구한 후, Bootstrap 분석(Felsenstein, 1985)을 1,000회 반복하여 bootstrap value를 산출하였다. 또한, matK와 psbA-trnH region에 대한 계통수뿐만 아니라 두 유전자의 염기서열을 조합한 계통수도 함께 작성하였다. Maximum likelihood analysis는 GTR + I + Γ 모델을 적용하여 RA×ML BlackBox(http://phylobench.
- 모든 염기서열 분석은 눈측백속 2종을 군외군으로 설정하여 유연관계를 검토하였다.
대상 데이터
- 한국산 향나무절 식물의 분자계통학적 유연관계를 밝혀내기 위하여 향나무절 식물 4분류군(향나무, 눈향나무, 섬향나무, 단천향나무)에 대하여 2011년부터 2013년까지 현지 조사를 통하여 직접 확보하였으며, 단천향나무는 러시아지 역에서 수집된 표본을 활용하였다. 또한 Mao et al.
- 또한 Mao et al.(2010)의 연구에서 군외군으로 사용되었던 눈측백속(Thuja L.) 2분류군과 노간주나무절 2분류군을 군외군으로 이용하였다. 본 연구에서 사용한 식물재료의 표본 정보는 Table 1에 정리하였다.
- DNA 추출을 위해 확보한 재료의 잎을 Silica gel로 건조시켜 사용하였으며, 건조표본을 이용할 경우 가능한 최근에 수집된 표본의 어린잎을 사용하였다. Total genomic DNA는 DNeasy plant mini kit (QIAGEN, Germany)을 이용하여 공급자의 매뉴얼에 따라 추출하였다.
- 1 (Applied Biosystems, USA)를 사용하였으며, 대상 유전자의 길이가 1kb를 넘는 matK의 경우 구간 내부의 primer를 이용하여 cycle sequencing하였다. 염기서열의 결정은 3730XL automated DNA sequencing system (Applied Biosystems, USA)을 이용하였다.
이론/모형
- 우리나라 향나무절 식물의 분포를 파악하기 위하여 국립생물표본관(KH) 소장 표본을 검토하였으며, 북한지역의 분포는 Chung (1943), Uykei (1926)의 문헌을 통해 확인하였고, 국외 분포파악을 위하여 Farjon (2005)의 문헌을 참고하였다. 또한 향나무의 울릉도 외 추가분포 파악을 위하여 Shin (2013)의 문헌을 검토하였다.
- 우리나라 향나무절 식물의 분포를 파악하기 위하여 국립생물표본관(KH) 소장 표본을 검토하였으며, 북한지역의 분포는 Chung (1943), Uykei (1926)의 문헌을 통해 확인하였고, 국외 분포파악을 위하여 Farjon (2005)의 문헌을 참고하였다. 또한 향나무의 울릉도 외 추가분포 파악을 위하여 Shin (2013)의 문헌을 검토하였다.
성능/효과
- 향나무절 4분류군에 대한 표본 및 문헌검토 결과 향나무는 중국의 안후이성과 관동성 등 남동쪽과 일본 그리고 우리나라 울릉도와 동해안 일대에 분포하며, 섬향나무는 일본 오키나와 일부지역과 우리나라 전남 해안과 섬지역에 분포한다. 눈향나무는 중국 흑룡강성지역과, 러시아 극동지역, 일본 혼슈지역에 일부 분포하며, 우리나라에서는 백두산 지역에서 백두대간 능선부를 따라 제주 한라산까지 분포하는 것으로 확인되었다. 단천향나무는 우리나라 백두산지역에서부터 중국 흑룡강성과 몽골, 러시아 극동부지역에 분포한다.
- matK 유전자의 염기서열변이 : 4분류군의 향나무절에 대한 matK 유전자를 분석하였으며, 1,186 bp (향나무, 섬향나무)~1,198 bp (눈향나무, 단천향나무)의 길이변이를 보였다. 다중정렬된 염기서열의 길이는 1,210개이고, 전체 염기서열 중 1,134개는 일정하였고, 76개의 변이가 있었으며, 그 중 72개가 계통학적으로 유효하였다.
- matK 유전자의 염기서열변이 : 4분류군의 향나무절에 대한 matK 유전자를 분석하였으며, 1,186 bp (향나무, 섬향나무)~1,198 bp (눈향나무, 단천향나무)의 길이변이를 보였다. 다중정렬된 염기서열의 길이는 1,210개이고, 전체 염기서열 중 1,134개는 일정하였고, 76개의 변이가 있었으며, 그 중 72개가 계통학적으로 유효하였다. G+C의 함량은 32.
- psbA-trnH region의 염기서열 변이 : 4분류군의 향나무 절에 대한 psbA-trnH region을 분석하였으며, 387 bp (눈향나무)~480 bp (향나무, 섬향나무)의 길이변이를 보였다. 다중정렬된 염기서열의 길이는 524개이고, 전체 염기서열 중 442개는 일정하였고, 82개의 변이가 있었으며, 그 중 74개가 계통학적으로 유효하였다.
- psbA-trnH region의 염기서열 변이 : 4분류군의 향나무 절에 대한 psbA-trnH region을 분석하였으며, 387 bp (눈향나무)~480 bp (향나무, 섬향나무)의 길이변이를 보였다. 다중정렬된 염기서열의 길이는 524개이고, 전체 염기서열 중 442개는 일정하였고, 82개의 변이가 있었으며, 그 중 74개가 계통학적으로 유효하였다. G+C의 함량은 33.
- MP tree에서는 향나무절이 99%의 BP로 지지되는 분계조를 형성하는 것으로 확인되었으며, 향나무절 내에서 두 개의 분계조를 형성하였다. 향나무+ 섬향나무 분계조는 100%의 BP로, 눈향나무+단천향나무 분계조는 95%의 BP로 지지되었다.
- psbA-trnH region : 4분류군에 대한 염기서열을 분석한 결과 85 step의 길이를 갖는 396개의 MP tree(CI = 0.976, RI = 0.976)를 도출하였다(Fig. 4). MP tree에서는 향나무절이 군외군인 노간주나무절 식물물들과 함께 붕괴된 node 내에서 100%의 BP로 지지되는 분계조를 형성하는 것으로 확인되었다.
- 4). MP tree에서는 향나무절이 군외군인 노간주나무절 식물물들과 함께 붕괴된 node 내에서 100%의 BP로 지지되는 분계조를 형성하는 것으로 확인되었다. 향나무절 내에서는 향나무+섬향나무 분계조가 73%의 BP로, 눈향나무+단천향나무 분계조는 59%의 BP로 지지되었다.
- matK 유전자와 psbA-trnH region 조합분석 : 4분류군에 대한 염기서열을 분석한 결과 164 step의 tree length를 갖는 99개의 strict consensus tree(CI=0.982, RI=0.984)를 도출하였다 (Fig. 3). MP tree에서는 향나무절이 93%의 BP로, 향나무+섬향나무 분계조와 눈향나무+단천향나무 분계조는 100%의 BP로 지지되었다.
- 3). MP tree에서는 향나무절이 93%의 BP로, 향나무+섬향나무 분계조와 눈향나무+단천향나무 분계조는 100%의 BP로 지지되었다. ML tree에서는 향나무절과 향나무절 내의 두 분계조 모두 100%의 BP에 의해 지지되었다(Fig.
- 본 연구의 결과에서는 향나무절이 바늘형과 비늘형의 잎을 모두가지고, 밑부분에 마디가 없으며, 꽃이 잔가지에 달리고, 실편이 3-8장씩 십자대생하거나 돌려난다는 공통형질을 갖는 단계통군이라는 것을 일부 지지하고 있다(Fig. 2, 3). 하지만 Fig.
- 향나무가 중국과 인접한 우리나라 서해안지역에는 분포하지 않고 동해안 지역에 분포하는 것은 지리적으로 특이한 일이다. 본 연구에서 향나무와 유전적으로 유사한 섬향나무가 서남해안 섬지역(대흑산도 등)에 분포하는 것으로 미루어 볼 때 서해안 지역에 분포하던 향나무가 환경의 변화에 적응하여 섬향나무로 분화된 것으로 판단된다. Huh et al.
- conferta)의 유전다양성 연구를 수행하였다. 분석결과 서해안 일대에 제한적으로 분포하는 해변노간주는 전국적으로 널리 분포하는 노간주나무와 비교하여 유전적 다양성이 낮은 것으로 보고하였으며, 진화경향성에 대하여 유전다양성이 높은 노간주나무로부터 유전다양성이 낮은 해변노간주가 분화하였을 것으로 추측하고 있다. 해변노간 주와 생육분포와 형태적 특성(누워서 자라는 형질)이 유사한 섬향나무도 유전적 근연관계인 향나무로부터 생육환경 차이로 인해 분화되어 진화되었을 것으로 판단된다.
- 눈향나무는 중국 흑룡강성지역과, 러시아 극동지역, 일본 Honshu지역에 일부 분포하며, 우리나라는 백두대간을 따라 제주도 한라산까지 분포한다. 우리나라에서는 지리적으로 해발 1,500 m 이상의 산지 능선부에 주로 분포하며, 본 연구결과 북부지방에 분포하는 단천향나무와 근연 관계인 것으로 확인되었다(Fig 2,3). 눈향나무가 고산지역에 제한되어 분포하고, 북방계식물인 단천향나무와 근연 관계인 것으로 볼 때 신생대 빙하기에 남하한 개체군들이빙하기 이후 고산지역에 제한적으로 남아 있게 된 것으로 추측된다(Chung et al.
후속연구
- 4). matK 유전자는coding gene이고, 향나무절 내에서 염기의 length variation이 뚜렷하게 나타나는 것을 보아 향나무절 및 향나무속의 계통을 규명하는데 있어 다소 높은 해상력을 제공할 수 있을 것으로 생각된다. 반면 psbA-trnH region은 non-coding gene이고, 6 bp 길이의 indel이 두 개, 29 bp 길이의 indel과 47 bp 길이의 indel이 각각 하나씩 관찰되었으나 indel을 제외한 나머지 염기에서 큰 차이를 보이지 않았다.
- 반면 psbA-trnH region은 non-coding gene이고, 6 bp 길이의 indel이 두 개, 29 bp 길이의 indel과 47 bp 길이의 indel이 각각 하나씩 관찰되었으나 indel을 제외한 나머지 염기에서 큰 차이를 보이지 않았다. 따라서 향후 이루어질 연구에서는 matK 유전자를 포함하여 다른 유전자를 이용하는 연구가 수행되어야할 것으로 생각된다.
- 본 연구결과 향나무절이 단계통군이라는 기존의 연구 결과를 일부 지지할 수 있을 것으로 판단되고, matK 유전자가 향나무절 및 향나무속의 계통을 규명함에 있어서 psbA-trnH region에 비하여 다소 높은 해상력을 제공할 수 있을 것으로 생각된다. 한국산 향나무절은 (1) 향나무+섬향나무 분계조 (2) 눈향나무+단천향나무 분계조의 두 분계조로 구분하는 것이 적합할 것으로 생각된다.
- 본 연구결과를 통해 그 동안 분류학적 유연관계가 불분명하였던 우리나라 향나무절 분류군들에 대해 유전적 근연관계를 파악하였으며, 앞으로 각 분류군들에 대한 정확한 진화경향성 파악을 위해서는 집단별 유전다양성 분석 등을 통한 세부조사가 필요할 것으로 판단된다.
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