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문제 정의
- 현재, 기능성 화장품 성분의 피부흡수에 대한 연구 보고가 부족하며, 인체에서의 in vivo 피부 흡수는 거의 보고된바 없다. 따라서 본 연구에서는 in vivo 라만 분광 피부 측정기를 이용하여 기능성 화장품 성분의 인체 표피 투과 데이터를 수집, 분석하여 추론하고, 이를 in vitro 결과와 비교하여 라만 분광 피부 측정기의 응용가능 성을 확인하고, 주요 성분의 피부 흡수 자료를 확보하고자 한다.
제안 방법
- Arbutin, niacinamide의 경우 48 h 이후부터 용출액이 검출되었으므로 48 h 전, 후 12 h 간격으로 확인하기 위해 36 h, 60 h에 용출액을 추가로 채취해 용출 간격이 짧을 때의 투과 정도를 확인하였다. In vitro 피부 투과 실험을 통해 기능성분의 피부 흡수 정도는 시간에 따라 모두 증가됨을 확인하였으나, adenosine 은 120 h까지 피부 투과가 이루어지지 않은 것으로 관찰되었다.
- Adenosine 은 고농도로 시험액을 만들어도 라만 스펙트럼이 잡히지 않아 분석을 할 수 없었기에 제외하였다. In vitro 평가 시험에서 시험액의 농도는 화장품기능성 허가 요건을 기준으로 현재 제품에 상용되는 농도를 기준으로 하였고, in vivo 평가 에서는 라만 분광 피부 측정기를 이용한 보고된 자료가 없어서 모두 0.1%로 통일하여 in vivo 흡수도를 상대 비교하고자 하였다.
- 각 시험물질의 라만 스펙트럼을 알아보기 위해 785 nm를 이용해서 fingerprint region (400 - 2,400 cm-1)을 4 µm 단위로 40 µm까지 측정하였다.
- 칼럼의 온도는 40 ℃를 유지하였고 10 µL 를 주입하였다. 시약 및 용매는 특급시약 및 HPLC grade를 사용하였고, 시료 분석을 위해 사용된 기기 조건은 다음과 같다(Table 1).
- 적출된 피부조직은 세포의 수용기 부분에 얹고 공여체 부분을 조립 후 시험물질을 1 mL 도포했다. 시험 물질 도포 직후를 0 h으로 하여 12, 24, 48, 72 h 경과 후 용출액을 채취하였으며 adenosine, vitamin C의 경우 96 h, 120 h 경과 후, arbutin, niacinamide의 경우 36 h, 60 h 에 용출액을 추가로 채취하였다. 이때 용액의 온도는 피부 내 온도와 같은 32.
- 시험물질에 따른 농도는 0.075% retinol, 0.3% retinyl palmitate, 2% ascorbyl glucoside, 1% kojic acid, 0.04 % adenosine, 2% vitamin C, 3% arbutin, 2% niacinamide로 제조하였다.
- 시험물질에 따른 농도는 retinol (Sigma, USA), retinyl palmitate (Sigma, USA), kojic acid (Sigma, USA), arbutin (Sigma, USA), ascorbyl glucoside (Sigma, USA), niacinamide (Sigma, USA), vitamin C (Sigma, USA), adenosine (Sigma, USA)을 100 ppm 농도로 제조하였다. 지용성 성분인 retinol, retinyl palmitate의 경우, propylren glycol (Sigma, USA) : ethanol (DAEJUNG, Korea) = 3 : 7의 비율로 한 용매를 만들어 사용하였고, 용출 액은 5% tween 80이 포함된 Phosphate Buffered Saline (PBS)를 이용하였다.
- 시험은 항온항습 조건(온도: 22 ± 2 ℃, 습도: 40 ~ 60%)에서 진행하였으며, 시험 시작 전 15분 이상 피험자들을 항온항습 조건이 유지되는 공간에서 안정화시켰다.
- 실험에 사용된 8가지 표준품의 HPLC-UV 결과를 토대로 in vitro 피부 투과 실험을 통해 8가지 기능 물질의 용출액을 0, 12, 24, 48, 72 h 경과 후 채취하였으며 adenosine은 72 h에도 용출액이 검출되지 않았고, vitamin C의 경우 72 h 이후부터 용출액이 검출되었으므로 96 h, 120 h까지 용출액을 채취해 장시간 경과 후 피부 투과 정도를 추가로 확인하였다.
- 시험 물질 도포 직후를 0 h으로 하여 12, 24, 48, 72 h 경과 후 용출액을 채취하였으며 adenosine, vitamin C의 경우 96 h, 120 h 경과 후, arbutin, niacinamide의 경우 36 h, 60 h 에 용출액을 추가로 채취하였다. 이때 용액의 온도는 피부 내 온도와 같은 32.5 ℃를 유지하였으며, 시간대별로 채취된 용출액은 high performance liquid chromatography-ultraviolet (HPLC-UV) 분석을 통해 함량 및 micrograms/sq.cm의 용출양을 계산하였다.
- 측정은 시료 부착 후 30 min, 60 min 대에 실시하였으며, 라만 스펙트럼을 피부 깊이 4 µm 단위로 40 µm까지 측정하고 분석하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 기기는 Agilent Technologies 1200 Series (Agilent technologies, USA)이다. 사용된 칼럼은 Shiseido Capcell pak C18 250 × 4.
- 사용된 칼럼은 Shiseido Capcell pak C18 250 × 4.6 mm, 5 µm을 공통으로 사용하였으나, 지용성 성분과 수용성 성분을 구분해서 사용하였다.
- 피부 투과 실험을 위해 6주령 수컷 쥐의 복부 부위를 피하조직까지 잘라 적출하고 -20 ℃에서 보관하였다. 수용성 성분 투과 실험의 경우 vertical-type diffusion cell에 PBS를 용출액으로 채웠고, 지용성 성분 투과 실험의 경우 5% tween 80이 포함된 PBS를 용출액으로 사용하였다. 적출된 피부조직은 세포의 수용기 부분에 얹고 공여체 부분을 조립 후 시험물질을 1 mL 도포했다.
- 본 실험에서는 Microette Plus 자동피부 투과기 (Hanson Research, USA)를 이용했다. 피부 투과 실험을 위해 6주령 수컷 쥐의 복부 부위를 피하조직까지 잘라 적출하고 -20 ℃에서 보관하였다. 수용성 성분 투과 실험의 경우 vertical-type diffusion cell에 PBS를 용출액으로 채웠고, 지용성 성분 투과 실험의 경우 5% tween 80이 포함된 PBS를 용출액으로 사용하였다.
- 피험자들은 알러지, 아토피 등 피부질환에 걸린 경험이 없는 20 ~ 30대 여성으로 총 4명으로 구성되었으며, 측정 당일 시험물질의 정확한 투과량을 조사하기 위해 스킨케어제품을 사용하지 않았다.
데이터처리
- 측정은 시료 부착 후 30 min, 60 min 대에 실시하였으며, 라만 스펙트럼을 피부 깊이 4 µm 단위로 40 µm까지 측정하고 분석하였다. 모든 측정 데이터는 컴퓨터에 자동 저장되며 분석프로그램인 Skin Tools 2.0을 이용하여 각 시험물질의 피부 투과량을 arbitrary unit (AU)으로 계산하였다.
이론/모형
- 물질 투과율 측정 시 인간의 피부를 in vivo 상에서 비침윤적으로 측정할 수 있는 Skin Composition Analyzer (model 3510 SCA, River Diagnostics, Netherlands)을 이용하였다. 이것은 라만 스펙트럼의 high wavenumber region (2,400 - 4,000 cm-1)와 fingerprint region (400 - 2,400 cm-1)이라 불리는 영역을 각각 671 nm, 785 nm 레이저를 이용해 측정한다[5].
- 본 실험에서는 Microette Plus 자동피부 투과기 (Hanson Research, USA)를 이용했다. 피부 투과 실험을 위해 6주령 수컷 쥐의 복부 부위를 피하조직까지 잘라 적출하고 -20 ℃에서 보관하였다.
성능/효과
- Adenosine의 경우는 in vitro에서는 전혀 흡수되지 않은 것으로 나타났고, in vivo에서는 라만 분광을 볼 수 없어 측정이 불가하였다. In vitro 평가에서는 ascorbyl-2-glucoside가 가장 우수한 투과율을 보였고, 반면 in vivo 평가에서는 retinol이 가장 우수한 투과율을 보였다.
- Arbutin, niacinamide의 경우 48 h 이후부터 용출액이 검출되었으므로 48 h 전, 후 12 h 간격으로 확인하기 위해 36 h, 60 h에 용출액을 추가로 채취해 용출 간격이 짧을 때의 투과 정도를 확인하였다. In vitro 피부 투과 실험을 통해 기능성분의 피부 흡수 정도는 시간에 따라 모두 증가됨을 확인하였으나, adenosine 은 120 h까지 피부 투과가 이루어지지 않은 것으로 관찰되었다.
- 각 시험물질을 피부에 흡수시킨 30 min 후에 물질의 피부 투과량을 측정한 결과 Figure 4와 같았다. 가장 높은 피부 투과율을 보인 물질은 retinol이었고, kojic acid, vitamin C, niacinamide, ascorbyl glucoside, arbutin, retinyl palmitate 순으로 투과율이 높았다(Figure 4A). 이것을 표피층별 피부 투과량으로 나타낸 결과 Table 3과 같다.
- 우선 in vitro 평가에서 투과율이 우수한 물질은 ascorbyl glucoside, retinol, retinyl palmitate, kojic acid였으며, in vivo 평가에서는 retinol, kojic acid이었다. 공히 두 가지의 시험에서 retinol은 투과율이 우수한 물질로 나타났다. Adenosine의 경우는 in vitro에서는 전혀 흡수되지 않은 것으로 나타났고, in vivo에서는 라만 분광을 볼 수 없어 측정이 불가하였다.
- 첫째, in vitro 평가는 모무생쥐 모델의 피부를 모두 관통하는 물질을 평가하는 것이고, 라만은 표피의 각질층을 평가하는 것이므로 물질의 특성에 따라서 표피 및 진피층의 영향에 민감할 수 있다. 둘째, Franz cell을 이용한 in vitro 평가는 물질이 장시간에 걸쳐 서서히 용출되므로 측정시간을 길게 한 반면, 라만을 이용한 평가는 초기 in vitro와 동일하게 12 h, 24 h 등으로 측정하려 했으나, 측정 결과 물질이 검출되지 않아, 도포 후 단시간(30 min, 60 min) 내에 측정을 해야 했는데, 이는 라만은 표피의 각질층을 대상으로 하기 때문에 물질이 이미 피부로 침투되어버린 경우는 측정이 안되기 때문으로 추측되며 in vitro와 in vivo 두 측정 간에 차이가 발생 했을 가능성이 있다고 생각된다.
- 물질 도포 60 min 후 피부 투과량 측정결과는 30 min 후에 측정한 결과와 동일하게 retinol이 가장 높은 투과율을 보였으며, kojic acid, vitamin C, niacinamide, ascorbyl glucoside, arbutin, retinyl palmitate순이었다 (Figure 4B). 표피층별 피부 투과량으로 나타낸 결과 Table 4와 같다.
- 실험에 사용된 8가지 기능 물질에서 공통적으로 채취한 12 h, 24 h, 48 h, 72 h에서의 용출양을 비교한 결과, 8가지 기능성분 중 가장 높은 피부 투과도를 보인 성분은 12 h을 기준으로 ascorbyl glucoside, kojic acid, retinol 순으로 확인되었고, 24 h에서는 ascorbyl glucoside, retinol, kojic acid, retinyl palmitate 순으로 확인되 었다(Figure 2). niacinamide, arbutin, vitamin C, adenosine은 24 h까지 피부 투과가 이루어지지 않은 것으로 관찰되었다.
- Franz cell을 이용한 평가와 라만 분광 피부 측정기를 이용한 평가에서 유사성과 차이점을 볼 수 있었다. 우선 in vitro 평가에서 투과율이 우수한 물질은 ascorbyl glucoside, retinol, retinyl palmitate, kojic acid였으며, in vivo 평가에서는 retinol, kojic acid이었다. 공히 두 가지의 시험에서 retinol은 투과율이 우수한 물질로 나타났다.
- 전반적으로 라만 분광 피부 측정기를 사용한 live in vivo 피부 흡수평가는 사용된 물질들의 자료를 살펴볼 때 상당히 신뢰성 있고, 의미있는 결과를 보여주었다(Table 4). 대부분 물질의 투과 장벽은 각질층이므로 각질층에서의 거동을 살펴보는 것이 의미있다고 생각 되며, 추후 tape striping법에 의한 in vitro 각질 투과도를 평가하여 비교 분석해 보는 것도 필요할 것으로 생각된다.
- 두 가지 측정 결과 나타나는 차이점은 몇 가지의 원 인에서 비롯되는 것으로 보여진다. 첫째, in vitro 평가는 모무생쥐 모델의 피부를 모두 관통하는 물질을 평가하는 것이고, 라만은 표피의 각질층을 평가하는 것이므로 물질의 특성에 따라서 표피 및 진피층의 영향에 민감할 수 있다. 둘째, Franz cell을 이용한 in vitro 평가는 물질이 장시간에 걸쳐 서서히 용출되므로 측정시간을 길게 한 반면, 라만을 이용한 평가는 초기 in vitro와 동일하게 12 h, 24 h 등으로 측정하려 했으나, 측정 결과 물질이 검출되지 않아, 도포 후 단시간(30 min, 60 min) 내에 측정을 해야 했는데, 이는 라만은 표피의 각질층을 대상으로 하기 때문에 물질이 이미 피부로 침투되어버린 경우는 측정이 안되기 때문으로 추측되며 in vitro와 in vivo 두 측정 간에 차이가 발생 했을 가능성이 있다고 생각된다.
- 각 물질의 시간대별(30 min, 60 min) 피부 투과량의 AU는 Table 5와 같다. 측정 결과 retinol에서 투과량의 차이가 가장 많이 나며, kojic acid, niacinamide, ascorbyl glucoside, arbutin, retinyl palmitate, vitamin C 순으로 투과량 차이가 크게 나타났다(Figure 5, Table 6). 이러한 차이는 30분 간 투과된 물질의 양으로 해석될 수 있다.
- 피부 투과 실험을 통해 시간대별로 채취된 용출액을 µg/sq · cm로 나타낸 결과 adenosine을 제외하고 모든 용출액이 시간이 지남에 따라 피부 흡수가 증가하는 것으로 관찰되었고(Figure 1), 이 결과는 Table 2와 같았다.
후속연구
- 결론적으로 in vivo 라만 분광 피부 측정기를 통해 향후 고기능성 제형 개발 및 피부에 대상 전달을 위한 자료 활용, 화장품 소재, 의약품 소재, 단백질, 펩타이드 등 다양한 물질의 경피 흡수 자료 확보, 피부흡수 개선제 연구, 개선된 피부 흡수도 평가 시험법 확립 및 흡수 가이드라인 자료로 활용, 화장품의 피부 흡수도 평가를 위한 과학적 평가 기술 확립, 고기능성 소재 및 화장품의 유효성 및 안정성 평가를 위한 기반 평가 기술 제공, 기능성 화장품소재 및 제품의 피부 흡수 자료를 확립하는데 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
- 전반적으로 라만 분광 피부 측정기를 사용한 live in vivo 피부 흡수평가는 사용된 물질들의 자료를 살펴볼 때 상당히 신뢰성 있고, 의미있는 결과를 보여주었다(Table 4). 대부분 물질의 투과 장벽은 각질층이므로 각질층에서의 거동을 살펴보는 것이 의미있다고 생각 되며, 추후 tape striping법에 의한 in vitro 각질 투과도를 평가하여 비교 분석해 보는 것도 필요할 것으로 생각된다.
- 따라서 적출된 피부가 경피 제제와 용출액에 장시간 접촉되었을 때 피부 손상 여부에 대한 연구가 추후 이루어질 필요가 있다고 생각된다. 물질에 따라 시간 별로 채취한 용출양의 오차범위가 큰 것은 in vitro 피부 투과 실험의 특성상 적출된 피부의 컨디션 및 두께 차이로 인한 변동이 크기 때문인 것으로 생각된다.
- 이러한 차이는 30분 간 투과된 물질의 양으로 해석될 수 있다. 또한, 대부분의 물질은 30 min에서 피부 투과량이 높게 나타났지만, vitamin C의 경우는 60 min에서 피부 투과량이 더 높게 나타났으므로 측정 시간대를 더 늘려서 확인을 하거나 농도를 달리 해봐야 할 필요가 있을 것으로 생각된다.
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