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문제 정의
- 또한 화장품은 그 자체의 구성성분이 다양하고 방해물질이 다량 존재하므로 이를 해결하기 위해서는 신속하면서도 정확한 분석법이 확립되어야 하므로 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 GC/FID 동시분석법의 과학적인 근거 및 타당성을 입증하기 위해 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 검출한계 및 정량한계 설정 등 분석법의 Validation을 실시하였다. 본 연구의 동시분석법을 이용하여 기존 방부제의 대체 성분으로 사용가능한 항균작용의 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 품질관리에 기초자료로 제시하고자 하였다[7,8].
제안 방법
- 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올 혼합 표준액을 직선성이 가장 좋은 범위에서 3회 동시 분석하여 얻어진 3개의 검량선 기울기 평균과 Y절편의 표준편차를 구해 2.5의 계산 식으로 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)를 산출하였다. 즉, 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올 중 1,2-pentanediol과 1.
- 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol 표준액 각각의 검량선의 직선성 범위가 좋은 부분을 이용하여 혼합 표준용액을 농도별로 희석하여 3회 동시 분석한 후 다음과 같은 식을 이용하여 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)를 산출하였다. 또한 검량선으로부터 산출된 검출한계와 정량한계를 검증하기 위해 계산된 농도로 검액을 조제 및 분석하여 검출한계의 S/N비가 3 이상, 정량한계의 S/N비가 10 이상 되는지를 확인하여 검량선으로부터 계산된 검출한계 및 정량한계 농도가 타당한지를 검증하였다.
- 즉 정량법의 경우 측정범위 내에서 농도 증가에 따라 비례하여 증가한다는 것을 증명해야 한다. 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol 혼합 표준액을 적당히 희석하여 각 농도별 혼합 표준액을 측정한 후 성분 농도별 분석 조건에 의한 피크 면적 비를 구하여 검량선을 작성하였다. 작성된 검량선으로부터 직선식의 상관계수를 구하여 직선성을 검토하였고, 3회 반복 측정하여 평가하였다.
- 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol의 표준시약을 1.0 g까지 무게를 달아 메탄올에 용해시켜 10,000 µg/g의 농도가 되도록 표준용액을 만들고, 이를 메탄올로 희석하여 100 ~ 1,200 µg/g의 농도범위로 희석하여 사용했다.
- GC/FID를 이용한 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 동시 분석법의 타당성을 검토하는 Validation은 특이성, 직선성, 정밀성(재현성), 정확성(회수율) 및 정량한계, 검출한계 등을 이용하여 검토하였다.
- 특이성은 공존이 예측되는 불순물, 분해물 및 배합 성분들이 서로 영향을 받지 않고 특이적으로 측정할 수 있는 능력이다. 대조액을 전 처리한 시험용액과 대조액에 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 혼합 표준액을 임의 투입한 분석시료를 조제한 후 전 처리하여 시험용액을 만들어 GC/FID로 측정하였고, 측정 후 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 주성분 피크의 일치여부를 비교하여 특이성을 판단하였다.
- 하지만 화장품에 사용되는 방부제들과 마찬가지로 항균 작용의 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 또한 피부 자극에 민감할 수 있으므로 화장품에 사용 시 어느 정도 제한이 되어질 것으로 판단된다. 따라서 본 연구에서 화장품 내에서 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 GC/FID 동시 분석법을 마련함과 동시에 분석법 Validation을 검토하여 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
- 따라서 본 연구에서는 항균 작용을 하는 직쇄상 1,2-알칸디올류 성분들 중 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol 3종의 성분을 로션 화장품 내에서 Gas chromatograpy / Flame ionization detector (GC/FID)로 동시 분석 방법을 시도하였다. 또한 화장품은 그 자체의 구성성분이 다양하고 방해물질이 다량 존재하므로 이를 해결하기 위해서는 신속하면서도 정확한 분석법이 확립되어야 하므로 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 GC/FID 동시분석법의 과학적인 근거 및 타당성을 입증하기 위해 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 검출한계 및 정량한계 설정 등 분석법의 Validation을 실시하였다.
- 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol 표준액 각각의 검량선의 직선성 범위가 좋은 부분을 이용하여 혼합 표준용액을 농도별로 희석하여 3회 동시 분석한 후 다음과 같은 식을 이용하여 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)를 산출하였다. 또한 검량선으로부터 산출된 검출한계와 정량한계를 검증하기 위해 계산된 농도로 검액을 조제 및 분석하여 검출한계의 S/N비가 3 이상, 정량한계의 S/N비가 10 이상 되는지를 확인하여 검량선으로부터 계산된 검출한계 및 정량한계 농도가 타당한지를 검증하였다.
- 또한 화장품 대조액에 800, 1,000, 1,200 µg/g 농도의 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 혼합 표준액을 첨가하여 화장품 검체를 만든 후 전 처리하여 농도 농도별로 각각 3회 반복 총 9번 동시 분석하여 측정된 시료 중 농도값의 상대표준 편차(% RSD)로 검액에 대한 재현성 즉, 반복성(Repeatibality)을 확인하였다.
- 또한 화장품 시료에서 각 성분의 계산된 검출한계와 정량한계의 타당성을 입증하기 위해 로션 제형의 화장품에 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 표준시약을 임의 투입하고 메탄올로 전처리하여 최종적으로 약 20, 30, 40, 60, 100 µg/g 농도가 되도록 한 시료 검액을 분석하였다.
- 따라서 본 연구에서는 항균 작용을 하는 직쇄상 1,2-알칸디올류 성분들 중 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol 3종의 성분을 로션 화장품 내에서 Gas chromatograpy / Flame ionization detector (GC/FID)로 동시 분석 방법을 시도하였다. 또한 화장품은 그 자체의 구성성분이 다양하고 방해물질이 다량 존재하므로 이를 해결하기 위해서는 신속하면서도 정확한 분석법이 확립되어야 하므로 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 GC/FID 동시분석법의 과학적인 근거 및 타당성을 입증하기 위해 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 검출한계 및 정량한계 설정 등 분석법의 Validation을 실시하였다. 본 연구의 동시분석법을 이용하여 기존 방부제의 대체 성분으로 사용가능한 항균작용의 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 품질관리에 기초자료로 제시하고자 하였다[7,8].
- 본 실험에 적용한 로션 제형의 화장품 대조액의 조성은 Table 1에 나타냈고, 이 화장품 대조액에 항균 작용의 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol의 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 표준시약을 각각 약 0.1 ~ 0.8% 함량으로 임의 투입한 로션 제형의 화장품을 농도별로 검체를 각각 약 10 g을 정밀히 칭량하여 100 mL 플라스크에 넣고, 메탄올을 약 80 mL가 되도록 첨가하여 30분간 초음파 추출 후 메탄올을 추가로 첨가하여 100 mL로 정용하여 분석시료로 사용하였다. 이 액을 Advantec syringe 필터(PTFE, 0.
- 또한 화장품 시료에서 각 성분의 계산된 검출한계와 정량한계의 타당성을 입증하기 위해 로션 제형의 화장품에 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 표준시약을 임의 투입하고 메탄올로 전처리하여 최종적으로 약 20, 30, 40, 60, 100 µg/g 농도가 되도록 한 시료 검액을 분석하였다. 시료 내 각각 분석된 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올의 피크 높이와 베이스라인 노이즈 비(S/N)를 구하여 검량선으로부터 계산하여 얻어진 검출한계와 정량한계의 농도값을 검증하였다. 그 결과 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 검출한계는 S/N비가 5 이상, 정량한계는 S/N비가 12 이상임이 확인되어 검량선으로부터 계산된 검출한계와 정량한계의 농도값이 타당함을 검증하였고 그 결과를 Table 3에서 나타내었다.
- 시험용액 및 혼합 표준용액은 1 µL를 주입하였으며, split ratio 10 : 1 조건으로 50 ℃에서 시료를 주입하고 5분간 유지한 후 10 ℃/min의 비율로 250 ℃까지 온도를 상승시켜 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol을 동시 분석하였다.
- 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol 혼합 표준액을 적당히 희석하여 각 농도별 혼합 표준액을 측정한 후 성분 농도별 분석 조건에 의한 피크 면적 비를 구하여 검량선을 작성하였다. 작성된 검량선으로부터 직선식의 상관계수를 구하여 직선성을 검토하였고, 3회 반복 측정하여 평가하였다.
- 정밀성은 검액에 대한 재현성을 확인하는 것으로 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 800 µg/g 농도의 검액을 6회 반복 측정하여 머무름 시간(retention time, Rt)과 측정값(area)의 상대표준편차(% RSD)로 시스템 적합성(System Suitability)을 확인하였다.
- 정확성은 분석 시료에 대한 회수율(% Recovery)을 확인하는 것으로 로션 제형의 화장품 대조액에 800, 1,000, 1,200 µg/g 농도의 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 혼합 표준액을 첨가하여 검체를 만든 후 농도별로 각각 3회 반복 총 9회 동시분석 하여 화장품에서 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 회수율(%)을 확인하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 이용된 시료는 로션 제형의 대조액과 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류를 임의 투입한 화장품을 검체로 사용하였고, 동시분석실험에 사용한 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올의 표준시약은 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol (Sigma-Aldrich, USA) 그리고 가스크로마토그래피용 메탄올을 사용하였다. 실험에 사용된 분석기기는 GC (Acme 6000, 영린기기, 한국), 분석 컬럼은 DB-WAX capillary column (60 m, 0.
- 이 표준액을 각각 10 mL를 취하여 혼합한 후, 메탄올을 넣어 100 mL로 하여 혼합 표준용액을 만들어 사용하였다. 분석에 사용한 GC는 FID가 장착된 Acme 6000 system (영린기기, 한국)을 사용하였고 주입구와 검출기의 온도는 각각 230 ℃와 250 ℃로 설정하였으며, 이동상으로는 질소가스 3.0 mL/min를 사용하였다. 시험용액 및 혼합 표준용액은 1 µL를 주입하였으며, split ratio 10 : 1 조건으로 50 ℃에서 시료를 주입하고 5분간 유지한 후 10 ℃/min의 비율로 250 ℃까지 온도를 상승시켜 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol을 동시 분석하였다.
- 실험에 사용된 분석기기는 GC (Acme 6000, 영린기기, 한국), 분석 컬럼은 DB-WAX capillary column (60 m, 0.25 mm id., 0.25 µm film thickness, Agilent J&W, USA), Detector는 FID (불꽃이온화 검출기)를 사용하였다.
- 45 µm)로 여과하여 시험용액으로 사용하였다. 표준용액의 조제는 Sigma-Aldich사에서 구입한 3종의 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol의 표준시약 약 1.0 g을 각각 정밀하게 칭량하여 메탄올에 넣어 100 mL로 한 액을 표준액으로 하였다. 이 표준액을 각각 10 mL를 취하여 혼합한 후, 메탄올을 넣어 100 mL로 하여 혼합 표준용액을 만들어 사용하였다.
성능/효과
- 1) 화장품 중 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류(1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol) 성분은 60 m DB-WAX 컬럼을 이용하여 injector 온도 230 ℃, detector 온도 250 ℃, 질소유량 3.0 mL/min 및 split ratio 10 : 1 조건으로 50 ℃에서 시료를 주입하고 5분간 유지한 후 10 ℃/min의 비율로 250 ℃까지 온도를 상승시켜 동시 분석했을 때 양호하게 분리되었다.
- 2) 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol 3종의 직쇄상 1,2-알칸 디올류 피크의 머무름 시간(Rt)은 각각 19.05 min, 20.21 min 및 22.44 min이었으며, 100 ~ 1,200 µg/g의 농도 범위에서 상관계수가 0.9991 이상의 양호한 직선성을 나타내었다.
- 3) 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol 3종의 직쇄상 1,2-알칸 디올류의 검출한계(LOD)는 각각 31, 40, 및 19 µg/g이었고, 정량한계(LOQ)는 각각 98, 108, 및 57 µg/g이었다.
- 특이성은 분석시료 내 다른 물질(불순물, 분해물, 배합성분 등)의 공존 시 해당 분석물질을 분리하고 정량하는 분석 능력을 나타낸다. 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올 표준액(1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol), 화장품 대조액 및 화장품 대조액에 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올 표준액을 투입한 분석시료를 GC/FID로 각각 측정한 결과 1,2-pentanediol 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol 혼합 표준액에서의 피크 머무름 시간(Retention time, Rt)은 각각 19.05, 20.21 및 22.44 min이었으며, 머무름 시간(Rt)의 % RSD는 0.025 ~ 0.035%로 재현성이 있어 분석에 적합하였다. 화장품 대조액에 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올을 투입한 분석시료에서도 일정하게 나타남을 Figure 1, 2 및 3에서 알 수 있었고, 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 각 성분 피크 머무름 시간(Rt)에 화장품 대조액에서 피크가 나타나지 않아 화장품 대조액의 기타 다른 성분들과 명확하게 분리할 수 있어 특이성을 확인할 수 있었다.
- 4) 화장품 중 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 GC/FID 동시 분석법에 대한 시스템의 적합성을 확인하였고, 검액의 농도별 반복성(재현성)의 상대표준편차(% RSD)는 약 2% 이하로 나타났으며 화장품 내에서 정확성(회수율)은 각각 99.3 ~ 103.3%, 99.4 ~ 106.7% 및 97.5 ~ 107.3%로 매우 양호하게 나타났다.
- 100, 800, 1,000 및 1,200 µg/g 4 point 농도로 희석된 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 혼합 표준액을 GC/FID로 3회 반복 분석하였을 때 얻은 피크면적을 Y축으로 표준액 농도를 X축으로 하여 검량선을 작성하였고, 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류를 분석하여 얻어진 상관 관계식을 Figure 4에 나타냈다. Table 2에서 알 수 있듯이 표준액 농도범위에서 R2 값이 모두 0.9991 이상을 나타냄에 따라 직선성이 매우 좋고 분석방법이 적합함을 알 수 있었다.
- 시료 내 각각 분석된 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올의 피크 높이와 베이스라인 노이즈 비(S/N)를 구하여 검량선으로부터 계산하여 얻어진 검출한계와 정량한계의 농도값을 검증하였다. 그 결과 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 검출한계는 S/N비가 5 이상, 정량한계는 S/N비가 12 이상임이 확인되어 검량선으로부터 계산된 검출한계와 정량한계의 농도값이 타당함을 검증하였고 그 결과를 Table 3에서 나타내었다.
- 정밀성은 하나의 균질화된 분석시료를 반복해서 분석할 때 재현성이 얼마나 좋으냐를 나타내는 것이다. 다시 말해 분석값이 평균치에 얼마나 근접하고 집중되어 있는냐를 나타내는 것이며, 실제 측정 시에는 n회 반복 시험하여 평균과 표준편차를 구한 후 상대표준편차(% RSD)를 확인하여 2% 이내면 적합한 것으로 본다. 표준편차가 크면 원인을 알 수 없는 오차인 우연 오차가 크다는 것을 말해 준다.
- 정확성은 분석 시료에 대한 회수율(% Recovery)을 확인하는 것으로 로션 제형의 화장품 대조액에 800, 1,000, 1,200 µg/g 농도의 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 혼합 표준액을 첨가하여 검체를 만든 후 농도별로 각각 3회 반복 총 9회 동시분석 하여 화장품에서 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 회수율(%)을 확인하였다. 로션 제형 화장품 내에서 1,2-pentanediol의 회수율은 99.3 ~ 103.3%, 1,2-hexanediol은 99.4 ~ 106.7% 및 1,2-octanediol의 회수율(%)은 97.5 ~ 107.3 % 이내로 각각 확인되어 화장품 내에서 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 동시 분석법의 정확성이 매우 우수한 것으로 Table 5에서 알 수 있었다.
- 하지만 HPLC ELSD, RI 검출기를 사용한 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 분석은 재현성, 분석컬럼 선택 및 분석 감도가 GC/FID 보다는 일반적으로 떨어진다. 본 실험에서 알 수 있듯이 GC/FID 기기를 이용하여 현재 화장품에 사용되는 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 동시분석 및 정량분석이 가능함을 증명하였다. 본 실험은 화장품에 적용하는 첫 번째 동시 분석으로 로션 제형에서만 분석을 진행하였지만 이 실험을 토대로 여러 제형의 화장품에서 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 정량분석 실험이 향후에는 이루어질 것으로 사료된다.
- 또한 화장품 대조액에 800, 1,000, 1,200 µg/g 농도의 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 혼합 표준액을 첨가하여 화장품 검체를 만든 후 전 처리하여 농도 농도별로 각각 3회 반복 총 9번 동시 분석하여 측정된 시료 중 농도값의 상대표준 편차(% RSD)로 검액에 대한 재현성 즉, 반복성(Repeatibality)을 확인하였다. 시스템 적합성(System Suitability)에 대한 결과는 Table 4에서 볼 수 있듯이 검액 중 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol의 머무름 시간(Rt) 및 측정값(area)의 상대표준편차(% RSD)는 매우 우수하게 나타났다. 또한 검액에 대한 재현성 즉, 반복성(Repeatability)에 대한 정밀성도 각각 농도별 검액들의 상대표준편차(% RSD)가 약 2%이하로 나타남을 Table 4에서 확인할 수 있었다.
- 정확성은 분석시료에 대한 회수율을 확인하는 것으로 분석시료의 참값(농도)에 대한 분석법에 의해 얻어진 평균 시험결과의 근접성을 의미하며, 실제 측정 시에는 측정범위 내 농도별로 1,2-pentanediol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 분석물질을 함유한 분석시료를 조제하여 n회 반복시험한 후 평균 회수율(%)을 구해 정확성을 확인하였다.
- 즉, 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올 중 1,2-pentanediol과 1.2-hexanediol은 31 ~ 40 µg/g의 검출한계와 98 ~ 108 µg/g의 검출한계를 나타냈고, 1.2-octanediol은 19 µg/g의 검출한계와 57 µg/g의 정량한계를 나타내었다.
- 035%로 재현성이 있어 분석에 적합하였다. 화장품 대조액에 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올을 투입한 분석시료에서도 일정하게 나타남을 Figure 1, 2 및 3에서 알 수 있었고, 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류 각 성분 피크 머무름 시간(Rt)에 화장품 대조액에서 피크가 나타나지 않아 화장품 대조액의 기타 다른 성분들과 명확하게 분리할 수 있어 특이성을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 본 실험에서는 화학 방부제 대체 원료로 사용할 가능성이 있는 자체 항균 작용의 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류에 대한 GC/FID 분석법의 타당성을 검증하였고, 이를 바탕으로 화장품 내에서 사용상 제한이 필요한 원료로 설정되었을 경우 품질관리에 대한 기초자료로 활용될 것으로 기대된다.
- 본 실험에서 알 수 있듯이 GC/FID 기기를 이용하여 현재 화장품에 사용되는 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 동시분석 및 정량분석이 가능함을 증명하였다. 본 실험은 화장품에 적용하는 첫 번째 동시 분석으로 로션 제형에서만 분석을 진행하였지만 이 실험을 토대로 여러 제형의 화장품에서 3종의 직쇄상 1,2-알칸디올류의 정량분석 실험이 향후에는 이루어질 것으로 사료된다.
- 항균작용의 직쇄상 1,2-알칸디올 중 대표적으로 1,2-octanediol (caprylyl glycol)과 1,2-hexanediol (ehtylhexyl glycerin) 성분 등이 화장품 내에서 항균작용 기능의 원료로 적용되어 사용하고 있다[3-6]. 하지만, 항균작용의 직쇄상 1,2-알칸디올류도 자극을 유발할 수 있으므로 화학 방부제와 마찬가지로 사용상의 제한 기준이 필요할 것으로 판단된다.
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