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문제 정의
- 뿌리혹병균의 검출을 위해 Ito 등(1999), Wallenhammar 등(2012)에 의해 종 특이적 프라이머가 제작되었고 국내 병원균 검출을 위한 프라이머가 Soh 등(2013)에 의해 개발되었다. 본 연구에서는 뿌리혹병균 검출 및 병원균의 양을 정량할 수 있는 보다 개선된 프라이머를 개발하고자 하였다.
- Plasmodiophora brassicae는 십자화과 작물에 뿌리혹병을 일으키는 주요 병원균이다. 본 연구에서는 뿌리혹병균의 신속 정확한 검출을 위해서 뿌리혹병균에 대한 새로운 종 특이적 프라이머를 개발하고자 하였다. 새롭게 개발된 프라이머들은 10종의 주요 토양병원균을 비롯하여 기주인 배추 DNA와는 반응하지 않고 P.
제안 방법
- DNase I의 불활성화는 5 μl Proteinase K(25 μg/μl)를 37℃에서 1시간 동안 처리한 후, 5 mM EDTA 300 μl를 처리하고, 최종적으로 80℃ hot block에서 5 분간 고열처리 하였다.
- PCR 반응액의 총량은 20 μl로 하고 주형 DNA는 1 μl를 사용하였고, 2 μM의 primer를 사용하였으며 iQTM SYBR Green Supermix(BIO-RAD)를 첨가하였다.
- PCR 반응액의 총량은 20 μl로 하고 주형 DNA는 1 μl를 사용하였고, 2 μM의 primer를 사용하였으며 iQTM SYBR Green Supermix(BIO-RAD)를 첨가하였다. PCR 조건은 95℃에서 5 분간 initial denaturation시켰고, 95℃/30초, 65℃/20초, 72℃/20초로 40 cycles 반응시킨 다음 72℃에서 5분간 final extension시킨 후, melt curve 값은 65℃에서 95℃까지 증가시켜 산출하였다.
- Quantitative real-time PCR 분석은 증폭산물의 크기가 129 bp로 real-time PCR에 적용 가능한 ITS1-1과 ITS1-2 프라이머를 이용하였다. PCR 반응액의 총량은 20 μl로 하고 주형 DNA는 1 μl를 사용하였고, 2 μM의 primer를 사용하였으며 iQTM SYBR Green Supermix(BIO-RAD)를 첨가하였다.
- 채집된 뿌리혹을 흐르는 물로 수 차례 씻어내어 토양입자와 불순물을 최대한 제거해 낸 후, 멸균된 메스와 가위를 이용하여 잘게 잘라낸 다음, 굵은 시험관(Pyrex, Ø30 mm)에 넣고 Homogenizer(IKA, 25 μm)로 잘게 마쇄하여 뿌리조직 내 휴면포자를 나출시켰다. 나출된 포자를 식물조직 및 토양 잔재물로부터 분리하기 위해 8겹의 거즈를 통해 걸러낸 후, 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 수거한 pellet에 멸균수를 첨가하고 원심분리기에서 15분간 씻어내는 과정을 2 차례 반복하였다. 최종적으로 수거한 pellet을 다음 실험 때까지 -20℃에 보관하였다.
- 프라이머의 종 특이성을 조사하고자 10종의 주요 토양전염성 병원균과 배추의 DNA 에 대해 앞서 개발한 프라이머 세트를 이용해 PCR 검정을 실시하였다. 또한 민감도를 알아보기 위해 P. brassicae의 포자를 105 spore/ml부터 10배씩 연속적으로 희석한 후 DNA를 추출하여 PCR 증폭을 실시하였다. PCR 반응 조건은 initial denaturation을 94℃에서 5분 간 실시한 후 denaturation 94℃/30초, annealing 65℃/20초, extension은 72℃/20초로 35 cycles을 수행하고 final extension을 72℃/5분 실시하였다.
- 민감도 검정을 위해 뿌리혹병균의 포자현탁액을 105 spore/ ml로 조정한 후 10배씩 희석한 다음 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA를 앞서 개발한 primer ITS1-1/ITS1-2를 이용하여 1차 PCR 증폭을 수행한 결과 포자 수 10개까지 검출이 가능하였다 (Fig.
- 수거된 휴면포자로부터 DNA를 추출하기 위한 동결건조 전처리 과정으로써 pellet에 50 unit/ml 농도의 DNase I (Sigma, D-4263) 50 μl, Streptomycin 300 ppm과 Rifampicin 100 ppm을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
- 전처리 후 동결건조된 pellet은 미세한 휴면포자의 세포벽을 효과적으로 파쇄하기 위해 Glass bead(0.09-0.15 mm)를 첨가하여 Pellet Pestile(Sigma)로 마쇄한 다음, 400 μl의 extraction buffer[200 mM Tris-Cl(pH 8.0), 200 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 1% PVP를 첨가하고 600 μl의 chloroform으로 추출하였다.
- 종 특이적 프라이머의 선발을 위해 Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)와 EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk)로부터 얻어진 P. brassicae의 ITS 영역 염기서열 정보를 토대로 참고하여 clustralW와 Oligonucleotide Properties Calculator(http://www.basic.north western.edu)를 활용하여 ITS1-1/ITS1-2와 ITS2-1/ITS2-2, PLF/PLR, PqF/PqR 등 총 4개의 프라이머 세트를 설계하였다(Fig. 1). 프라이머의 합성은 Genotech(Korea)사에 의뢰하였다(Table 1).
- 채집된 뿌리혹을 흐르는 물로 수 차례 씻어내어 토양입자와 불순물을 최대한 제거해 낸 후, 멸균된 메스와 가위를 이용하여 잘게 잘라낸 다음, 굵은 시험관(Pyrex, Ø30 mm)에 넣고 Homogenizer(IKA, 25 μm)로 잘게 마쇄하여 뿌리조직 내 휴면포자를 나출시켰다.
- 프라이머의 종 특이성을 조사하고자 10종의 주요 토양전염성 병원균과 배추의 DNA 에 대해 앞서 개발한 프라이머 세트를 이용해 PCR 검정을 실시하였다. 또한 민감도를 알아보기 위해 P.
-
프라이머의 특이성 및 민감도 검정.
대상 데이터
- 사용한 배추뿌리혹병균(P. brassicae)은 강원도 평창, 인제, 홍천, 대관령, 강릉, 원주와 경기도 안성, 충남 홍성, 전라남도 해남, 진도 등 10여 곳의 배추 재배지역 포장으로부터 500여개의 뿌리혹을 채집하여 휴면포자를 분리한 다음 실험에 사용하였다.
이론/모형
- DNA는 Jang(2006)의 방법으로 분리 및 정제하였다. 수거된 휴면포자로부터 DNA를 추출하기 위한 동결건조 전처리 과정으로써 pellet에 50 unit/ml 농도의 DNase I (Sigma, D-4263) 50 μl, Streptomycin 300 ppm과 Rifampicin 100 ppm을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
성능/효과
- Quantitative real-time PCR로 분석할 경우에는 더 적은 수의 포자까지 안정적으로 검출해 낼 수 있어 새로운 P. brassicae 종 특이적 프라이머로서의 유용성을 확인할 수 있었다.
- 그 가운데 Primer ITS1-1/1-2는 민감도 검정 결과, 10 spores/ml의 DNA까지 검출이 가능함으로써, first round PCR용임에도 불구하고 이전의 검출법 보다 감도가 높고 정확한 결과를 얻었다.
- 또한 quantitative real-time PCR 검정을 위해 포자현탁액을 103 spores/ml로 조정한 후 DNA를 분리한 것을 10배씩 희석하고 ITS1-1/ITS1-2를 이용하여 quantitative real-time PCR을 수행했을 때 10-1까지 검출이 가능하였다(Fig. 4).
- 분리한 DNA를 앞서 개발한 primer ITS1-1/ITS1-2를 이용하여 1차 PCR 증폭을 수행한 결과 포자 수 10개까지 검출이 가능하였다 (Fig. 3).
- 4). 이는 실험방법과 샘플에 다소 차이가 있으나 민감도에서 기존의 Wallenhammar 등(2012)에 의해 개발된 real-time PCR용 프라이머의 민감도 500 resting spores/g-1 soil 보다 높은 민감도를 보였으며, 또한 희석된 DNA의 threshold cycle 값에 의해 작성된 standard curve 값(Fig. 4a)을 통해 여러 샘플 간의 DNA 농도에 대한 상대적인 정량이 가능하였다. 본 결과를 토대로 Real-time PCR에서 SYBR Green을 활용한 균주 특이적인 quantitative real- time PCR 검정이 가능할 것으로 사료된다.
- 3). 이전 연구에서 사용되었던 Faggian 등(1999)에 의해 개발된 특이적 primer PbITS set는 검출 민감도가 first round PCR에서는 포자 수 100개까지, nested PCR에서는 10개의 포자까지 증폭이 가능하여 ITS1-1/1-2의 민감도와 같지만 nested PCR은 극히 민감한 PCR로 실험방법도 더 까다로워 실제적으로는 first round PCR만을 수행하는 경우가 많기 때문에 본 연구에서 개발된 ITS1-1/1-2를 사용한 PCR 검정이 병원균 검출에 보다 유용할 것으로 판단된다. 또한 quantitative real-time PCR 검정을 위해 포자현탁액을 103 spores/ml로 조정한 후 DNA를 분리한 것을 10배씩 희석하고 ITS1-1/ITS1-2를 이용하여 quantitative real-time PCR을 수행했을 때 10-1까지 검출이 가능하였다(Fig.
- 증폭산물의 크기가 129 bp로 quantitative real-time PCR 사용에 가장 적합했던 ITS1-1/ITS1-2를 이용하여 특이성 검정을 실시한 결과, 토양 내에 존재하는 주요 병원균인 Alternaria sojae, Fusarium oxysporum, Didymella bryoniae, Phytophthora infestans, Pythium ultimum, Colletotrichum acutatum, Botrytis cinerea, Cylindrocarpon destructans, Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae 등 다른 병원균 및 식물체의 DNA는 증폭이 이루어지지 않고 뿌리혹병균의 DNA만 증폭된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 프라이머 ITS1-1/ITS1-2와 ITS2-1/ITS2-2, PLF/PLR, PqF/PqR를 이용하여 3개의 이병 배추뿌리혹으로부터 분리한 휴면포자의 DNA를 PCR 증폭한 결과, 4개의 primer set 모두 P. brassicae의 DNA를 증폭하였다. 증폭산물의 크기가 129 bp로 quantitative real-time PCR 사용에 가장 적합했던 ITS1-1/ITS1-2를 이용하여 특이성 검정을 실시한 결과, 토양 내에 존재하는 주요 병원균인 Alternaria sojae, Fusarium oxysporum, Didymella bryoniae, Phytophthora infestans, Pythium ultimum, Colletotrichum acutatum, Botrytis cinerea, Cylindrocarpon destructans, Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae 등 다른 병원균 및 식물체의 DNA는 증폭이 이루어지지 않고 뿌리혹병균의 DNA만 증폭된 것을 확인할 수 있었다(Fig.
후속연구
- 본 결과를 토대로 Real-time PCR에서 SYBR Green을 활용한 균주 특이적인 quantitative real- time PCR 검정이 가능할 것으로 사료된다.
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