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문제 정의
- 본 연구는 향장원료로써 강황 잎의 항산화력을 증진시키기 위하여 초고압 공정을 이용해 식물의 유용활성물질의 손실을 최소화하며 단시간 내에 추출이 가능하도록 하였다. 또한, 대규모로 폐기되는 강황의 부산물인 잎을 사용해 초고압 공정추출로 항산화 효능을 증진시킴으로써 낮은 가격으로 최대의 효능을 나타내는 방법을 제시하여 강황 잎의 높은 항산화력을 가지는 화장품 원료로의 이용가치를 높이고자 연구를 수행하였다.
- 본 연구는 향장원료로써 강황 잎의 항산화력을 증진시키기 위하여 초고압 공정을 이용해 식물의 유용활성물질의 손실을 최소화하며 단시간 내에 추출이 가능하도록 하였다. 또한, 대규모로 폐기되는 강황의 부산물인 잎을 사용해 초고압 공정추출로 항산화 효능을 증진시킴으로써 낮은 가격으로 최대의 효능을 나타내는 방법을 제시하여 강황 잎의 높은 항산화력을 가지는 화장품 원료로의 이용가치를 높이고자 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 3-(4,5-dimethythiazo-2-yl)-2,5-dipheny-tetrazoliumbromide (MTT)를 사용하여 Mosmann (1983) 방법을 변형시켜 세포 생존율을 측정하였다. CCD-986sk 세포를 96 well plate에 1.
- CCD-986sk 세포를 96 well plate에 1.5 × 10⁴ cells/well 농도로 접종한 후, 80% 정도의 배양시점에서 각 well에 공정별 강황 잎 추출물을 투여하고 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다.
- Caffeic acid (Sigma, USA)를 0 ~ 100 μg/ml의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로부터 시료 추출물의 총 페놀함량을 산출하였다.
- Quercetin (Sigma, USA)를 표준물질로 하여 0 ~ 100 μg/ml의 농도범위에서 얻어진 표준 검량선으로부터 추출물의 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.
- )은 전북지역에 자생하고 있는 것을 2011년 9월 중 잎 부분만 채취하였으며, 동결건조기(PVTFD 100R, ILSHINLAB, Korea)를 이용하여 진공도 10 mm Torr, −70℃ 조건에서 동결건조 하였다. 건조수율은 건조 전 시료에 대한 건조 후 무게백분율로 계산하였다.
- 공정별 강황 추출물의 전자공여작용 (Electron Donating Abilities, EDA)은 각각의 추출물에 대한 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)의 전자공여 효과로 각 시료의 환원력을 측정하였다. 즉, 에탄올 1 ml, 시료 10 μl, 100 mM sodium acetate buffer (pH 5.
- 2 ml을 첨가하여 25℃에서 10분간 반응시키고 1 N HCl 1 ml을 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양은 420 nm에서 UV spectrophotometer (Tecan, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였으며 SOD 유사활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 백분율로 나타내었다.
- 실험에 사용된 각 공정별 추출물의 농도는 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/ml로 조절하여 인간섬유아세포인 CCD-986sk에 대한 세포독성을 측정하였다. 실험 결과 Fig.
- 열수 추출(WE)은 수직 환류냉각기가 부착된 flask에 10배의 증류수를 이용하여 70℃에서 24시간 동안 추출하였으며, 에탄올 추출물 (EE)은 열수추출과 같이 수직 환냉각기가 부착된 flask에 10배의 70% ethyl alcohol을 이용하여 동일한 온도와 시간에서 추출하였다.
- 초고압 공정을 병행하였을 시 총 페놀 화합물과 플라보노이드 함량이 초고압 공정을 가하지 않은 시료보다 다소 증가한 것으로 보아 활성성분의 용출이 고압으로 인하여 증진된 것으로 보인다. 이 실험으로 항산화에 중요한 물질인 총 페놀과 플라보노이드 함량을 확인함으로써 강황 잎의 항산화 활성 증진을 확인하였다.
- , 2004). 이러한 단점을 보완하기 위해 초고압 공정 기술을 천연물 활성성분 추출에 적용하였다.
- 초고압 추출은 동결 건조시킨 강황 잎 10 g을 비닐 팩에 물과 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압추출장치 (Ilshin autoclave, Daejeon, Korea)를 이용하여 500 Mpa의 압력으로 각각 5분(Ultra High Pressure Extraction 5, HPE5), 15분간 (Ultra High Pressure Extraction 15, HPE15) 초고압 추출을 시행하였다. 초고압 추출이 끝난 강황 잎을 수직 환류냉각기가 부착된 flask에 10배의 증류수를 이용하여 70℃에서 12시간동안 추출하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 강황 (Curcuma longa L.)은 전북지역에 자생하고 있는 것을 2011년 9월 중 잎 부분만 채취하였으며, 동결건조기(PVTFD 100R, ILSHINLAB, Korea)를 이용하여 진공도 10 mm Torr, −70℃ 조건에서 동결건조 하였다.
- 실험에 사용된 세포는 Dulbeco's Modified Eagle’s Medium (Gibco, USA) 배지 90%에 FBS를 10%로 적용시켜 배양하여 실험에 이용하였다.
- 실험에 이용된 세포주로 Human fibroblast CCD-986sk (KCLB 21947, Korea)를 사용하였으며, 세포배양에 필요한 배지로 Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium (Gibco, USA)을 사용하였고, 그 밖의 세포 배양에 필요한 시약으로 hepes buffer (Sigma, USA)와 fetal bovine serum (Gibco, USA), gentamycin sulfate (Sigma, USA), trypsin-EDTA (Sigma, USA)를 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험의 데이터 통계처리는 3회 반복으로 행해졌으며, 실험값의 통계는 SAS (Statistical Analysis System) 프로그램의 student t-test를 통해 평균값을 구하여 처리한 뒤, 처리구간의 최소유의수준의 차 (p < 0.05)로 통계처리 하였다.
이론/모형
- SOD 유사활성은 Marklund와 Marklund (1975)의 방법에 따라 과산화수소로 전환반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. 즉, 각 공정별 강황 추출물 0.
- 총 페놀함량은 Folin-Denis (Gutfinger, 1981) 방법에 따라 공정별 강황 추출물 1 ml에 Folin-Ciocalteau 시약 및 10% Na2CO3 용액을 각 1 ml씩 차례로 가한 다음 실온에서 1시간 정치한 후 spectrophotometer (UV 1600 PC, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. Caffeic acid (Sigma, USA)를 0 ~ 100 μg/ml의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로부터 시료 추출물의 총 페놀함량을 산출하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 Moreno (2000) 방법에 따라 공정별 강황 추출물 0.5 ml에 10% aluminum nitrate 0.1 ml 및 1 M potassiumacetate 0.1 ml, ethanol 4.3 ml를 차례로 가하여 혼합하고 실온에서 40분간 정치한 다음 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin (Sigma, USA)를 표준물질로 하여 0 ~ 100 μg/ml의 농도범위에서 얻어진 표준 검량선으로부터 추출물의 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.
성능/효과
- 같은 샘플에서 농도에 따라 추출물의 radical 소거활성의 큰 차이는 보이지 않았으나 같은 농도에서는 초고압 5분 강황 잎 추출물과 초고압 15분 강황 잎 추출물을 제외하고는 유의적인 차이를 보였다. 1 mg/ml의 농도에서의 강황 잎 추출물의 DPPH radical 소거활성은 에탄올 추출물, 열수 추출물, 초고압 5 분, 초고압 15분 강황 잎 추출물이 각각 80.11%, 74.65%, 84.26%, 86.15%로 초고압 15분 강황 잎 추출물이 가장 높은 자유라디칼 소거력을 보였으며, 가장 낮은 열수 강황 잎 추출물에 비해 12% 정도 활성이 증진된 것을 확인할 수 있었다. 약용식물의 항산화 활성 연구에서 1 mg/ml 농도의 오가피, 산수유 추출물이 약 70 ~ 77%의 자유라디칼 소거력을 나타낸 것 (Jung et al.
- 2에 나타내었다. 같은 샘플에서 농도에 따라 추출물의 radical 소거활성의 큰 차이는 보이지 않았으나 같은 농도에서는 초고압 5분 강황 잎 추출물과 초고압 15분 강황 잎 추출물을 제외하고는 유의적인 차이를 보였다. 1 mg/ml의 농도에서의 강황 잎 추출물의 DPPH radical 소거활성은 에탄올 추출물, 열수 추출물, 초고압 5 분, 초고압 15분 강황 잎 추출물이 각각 80.
- 3에 나타내었다. 같은 샘플의 경우에 농도에 따라 미미한 차이를 보여 큰 유의적 차이는 나타나지 않았으며, 샘플간에는 모두 유의적인 차이를 보였다. 초고압 15분 강황 잎 추출물이 1.
- 1을 살펴보면 에탄올 추출물이 모든 농도에서 가장 세포독성이 높았다. 대부분 농도 의존적으로 모든 시료가 유의적인 차이를 보이며 세포독성이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 초고압 15분 처리 강황 잎 추출물이 거의 모든 농도에서 가장 낮은 세포독성을 나타내었다. 에탄올 추출물이 1.
- 또한 플라보노이드 함량은 페놀화합물과 유사한 경향으로 초고압 15분 추출물이 124.33 μg/mg으로 열수 추출물과 에탄올 추출물이 각각 95.68 μg/mg 및 106.87 μg/mg으로 측정 된 것과 비교해 15% 가량 높은 수치를 나타내었다.
- , 2007), 이를 통하여 고압공정에 의해 조직 및 세포벽의 파괴로 세포 내의 유용 활성성분 용출이 극대화되며 종래의 추출법으로는 용출이 어려웠던 활성성분까지 추출이 가능하여졌기 때문으로 사료된다. 본 연구의 추출물 중 초고압을 15분 동안 가하여 추출한 강황 잎 추출물이 25.5%의 가장 높은 수율을 보였으며, 열수추출물이 18.3%의 가장 낮을 수율을 보였다. 이를 통하여 초고압 추출공정이 강황 잎 추출 수율 증가에 효과적이라는 것을 알 수 있었다.
- 0 mg/ml로 조절하여 인간섬유아세포인 CCD-986sk에 대한 세포독성을 측정하였다. 실험 결과 Fig. 1을 살펴보면 에탄올 추출물이 모든 농도에서 가장 세포독성이 높았다. 대부분 농도 의존적으로 모든 시료가 유의적인 차이를 보이며 세포독성이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 초고압 15분 처리 강황 잎 추출물이 거의 모든 농도에서 가장 낮은 세포독성을 나타내었다.
- 15%로 초고압 15분 강황 잎 추출물이 가장 높은 자유라디칼 소거력을 보였으며, 가장 낮은 열수 강황 잎 추출물에 비해 12% 정도 활성이 증진된 것을 확인할 수 있었다. 약용식물의 항산화 활성 연구에서 1 mg/ml 농도의 오가피, 산수유 추출물이 약 70 ~ 77%의 자유라디칼 소거력을 나타낸 것 (Jung et al., 2004)과 비교하면 본 연구 결과에서 강황 잎의 초고압 추출물이 77%이상의 뛰어난 활성산소 소거력을 나타냈다는 것을 알 수가 있다. 이러한 결과는 고압 추출 공정을 통하여 강황 잎 세포 및 조직의 파괴로 인해 유용물질의 용출이 증가된 것이라 사료된다.
- 대부분 농도 의존적으로 모든 시료가 유의적인 차이를 보이며 세포독성이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 초고압 15분 처리 강황 잎 추출물이 거의 모든 농도에서 가장 낮은 세포독성을 나타내었다. 에탄올 추출물이 1.0 mg/ml의 농도에서 9.5%의 세포독성을 보였으며 열수 추출물, 초고압 5분 추출물 및 초고압 15분 추출물은 같은 농도에서 각각 5.2%, 4.3%, 3.89%의 세포독성을 보였다. 이는 고로쇠수피 초고압 추출물의 항암활성 증진에 대한 연구결과에서 같은 1 mg/ml의 고로쇠 추출물이 20.
- 3%의 가장 낮을 수율을 보였다. 이를 통하여 초고압 추출공정이 강황 잎 추출 수율 증가에 효과적이라는 것을 알 수 있었다.
- 같은 샘플의 경우에 농도에 따라 미미한 차이를 보여 큰 유의적 차이는 나타나지 않았으며, 샘플간에는 모두 유의적인 차이를 보였다. 초고압 15분 강황 잎 추출물이 1.0 mg/ml의 농도에서 66.25%의 가장 높은 활성을 나타내었다. 표준검량 물질로 사용되어진 ascorbic acid가 81%의 활성을 나타낸 것과 비교하면 다소 낮은 결과를 보였다.
- , 2006)과 비교하여 강황 잎의 폴리페놀 함량이 현격히 높게 나타난 것을 알 수 있다. 초고압 공정을 병행하였을 시 총 페놀 화합물과 플라보노이드 함량이 초고압 공정을 가하지 않은 시료보다 다소 증가한 것으로 보아 활성성분의 용출이 고압으로 인하여 증진된 것으로 보인다. 이 실험으로 항산화에 중요한 물질인 총 페놀과 플라보노이드 함량을 확인함으로써 강황 잎의 항산화 활성 증진을 확인하였다.
- 총 페놀 화합물 함량은 열수 추출물이 282.92 μg/mg로 가장 낮은 함량을 보였고, 에탄올 추출물 283.56 μg/mg, 초고압 5분 추출물이 301.67 μg/mg, 초고압 15분 추출물이 308.28 μg/mg 순으로 높은 함량을 보였다.
- Table 1에 강황 잎 추출물의 추출 조건별 수율을 나타내었다. 추출 수율 측정을 통해 저온 고압 공정을 이용한 강황 잎 추출물이 일반 추출 공정을 이용한 추출물에 비해 약 1.5배 수율이 향상된 것을 확인하였다.
후속연구
- 89%의 세포독성을 보였다. 이는 고로쇠수피 초고압 추출물의 항암활성 증진에 대한 연구결과에서 같은 1 mg/ml의 고로쇠 추출물이 20.12%를 나타낸 것 (Jeong et al., 2009)과 비교해 현저하게 낮은 세포독성을 보임으로써, 추후 식품이나 향장 원료로서 사용될 가능성이 있을 것으로 사료된다. 이 결과를 토대로 강황 잎에 함유된 세포독성을 유발할 수 있는 물질이 초고압공정을 이용했을 때, 그 독성 물질이 변성되거나 파괴되어 강황 잎 추출물의 독성을 완화하는데 탁월한 효과가 있는 것으로 사료된다 (Ling et al.
- , 2012). 이렇듯이 폐자원인 강황의 잎을 활용하여 신소재를 발굴하고 사용하는 연구가 활발하게 이루어진다면 새로운 고부가가치 산업 성장의 동력이 될 것으로 사료된다.
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