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문제 정의
- 미생물의 생육에 영향을 미치는 요인으로는 탄소원, 질소원, 온도, 산소, pH 및 염농도 등이 있다. 그 중에서 본 분리 균주의 생육에 미치는 pH 또는 염류(NaCl)의 영향을 조사하였다. 자생식물 S.
- 후)그의의를">그 의의를 갖는다. 따라서 본 연구에서는 독도에 자생하는 해안식물 A. sphathulifolius, L. mauritiana, S. oryzifolium의 근권 세균을 분리하고, 동정하였고 이들 세균의 다양성을 조사하고 근권 토양의 세균 집단 조성을 분석하였다.
제안 방법
- PCR로 증폭한 단편들은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정제한 후, 염기 서열 결정을 위해ABI PRISM BigDye Terminator cycle Sequencing Kit (PE Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 sequencing 반응을 수행하여, 생산된 DNA단편들은 ABI 310 DNA sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA)를 사용하여 분석하였다[24]. 배양된 균체로부터 DNA를 분리하여 16S rDNA영역의 원핵미생물을 분리하기 위하여 tryptic soy agar 배지, marine agar 배지를 사용하였다. 그리고 pH (pH: 5.5, 7, 9)와 염농도(salinity: %, 농도구배조건(%): 3.5, 5, 7, 9, 12, 15, 20)에 따라 스크리닝 기법을 적용하여 고체배지에 균원 시료 희석용액을 100 ul씩 도말하고 세균은 30℃에서 1일간, 배양하여 형성된 각각의 독립 colony를 형태 및 색깔 등을 기준으로 분리하였다. 분리한 근권세균의 계통관계를 분석하기 위하여 세균의 염기서열을 MEGA 5.2프로그램 Neighbor-Joining (1000 bootstrap replicates) 방법을 수행하여 분석하였다[12]. ">분석하였다[24]. 배양된 균체로부터 DNA를 분리하여 16S rDNA영역의 서열을27 forward, 1492 reverse primer을 사용하여 확인하여 동정한 후, 분석하여 다양한 서식지 식물들과 원핵미생물의 유전적 특징에 기초하여 균주의 다양성을 확인하였다[25]. 모든 균주의 본 연구에 분리 동정된 근권세균들 간의 유연관계를 확인하기 위하여 계통수를 작성하였다(Fig. 1).
대상 데이터
- Soil samples were collected from around roots of three plants species (Sedum oryzifolium, So; Lysimachia mauritiana, Lm; and Aster sphathulifolius, As) native to Dokdo.
- 세 가지 식물 뿌리 주변의 토양으로부터 분리된 세균의 염기서열을 분석하여 동정을 수행하였으며, NCBI의 GenBank로부터 accession No. [KF740538-KF740564]를 제공 받았다(Table 1, 2). 본 연구 결과로 얻어진 3종의 식물에서 원핵미생물의 분포는 계통학적 분석을 수행하였을 때 크게 4문 19종에 속함을 알 수 있었다(Table 3).
- 근권 토양 샘플로부터 다양한 균주의 분리를 위하여 선택배지(Marine broth &agar medium, MA)를 사용하였다.
- 본 연구에서 사용된 식물시료는 독도에서 자생하는 땅채송화(Sedum oryzifolium, So; 37° 14' 22.02" N, 131° 52' 6.11" E), 갯까치수영(Lysimachia mauritiana, Lm; 37° 14' 22.69" N, 131° 52' 10.09" E), 해국(Aster sphathulifolius, As; 37° 14' 22.78" N, 131° 52' 10.17" E)을 사용하였다(Table 1).
- 후)균원시료로">균원 시료로 사용하였다. 원핵미생물을 분리하기 위하여 tryptic soy agar 배지, marine agar 배지를 사용하였다. 그리고 pH (pH: 5.
데이터처리
- ">확인하였다[25]. 모든 균주의 염기 서열들은 NCBI GenBank database의BLASTN으로 동정되었고 Ez-Taxon database와 비교하여 계통을 확인하였다.
이론/모형
- Phylogenetic analysis of rhizosphere microorganisms isolated from three plant species native to the Dokdo Island. A phylogenetic tree was constructed by using the neighbor-joining method (1,000 bootstrap replications). The twenty seven taxa belong to the four phyla (Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, and Proteobacteria).
- Rhizosphere microorganisms were isolated from three native plant species, and were analyzed using Shannon’s diversity index (H’) at the genus level.
- 근권 세균의 다양성 분석을 위하여 Shannon’s diversity index (H)를 적용하여 분석 확인하였다[2, 4, 25].
- 독도에 자생하는 해양 식물로부터 분리된 근권세균의 유전학적 다양성을 확인하기 위하여 Shannon’s diversity index를 이용하여 확인하였다.
성능/효과
- The isolated microorganisms were classified into nineteen species belonging to the four phyla (Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, and Proteobacteria). The table shows the distribution ratio of all isolated bacterial strains, identified to the phylum, order and genus (%).
- 그람음성균">3). 그람음성균 이면서 프로테오박테리아문에 속하는 4가지 강 중에 주로 Alphaproteobacteria강과 Gammaproteobacteria강이 확인되었고, 여기에 속하는 Alteromonadales목, Oceanospirillales목, Rhizobiales목, Rhodobacterales목의 근권세균이 확인되었다 (Table 3). 기존 연구결과를 보았을 때, 토양에 존재하는 세균 중 독도">확인하였다. 독도 자생 식물로부터 분리된 내생진균류의 다양성 지수는 S. oryzifolium (2.20), L. mauritiana (2.20), A. sphathulifolius (2.04)으로 확인되었다(Table 4). 세 가지 식물 중에 S.
- 독도의 자생식물 S. oryzifolium에서는 Rhodobacterales목 (Order)에 Paracoccus (P.)속, Loktanella (Lok.)속에 속하는 세균이 확인되었고, Micrococcales목에 속하는 Isoptericola (I.)속, Kytococcus (K.)속이 확인되었으며, Corynebacteriales목에 속하는 Gordonia (Gor.)속과 Flavobacteriales목에 속하는 Gillisia (Gill.)속, Oceanospirillales목에 속하는 Salinicola (S.)속이 확인되었다. 또한 Bacillales목에 속하는 Halobacillus 후)토양에는">토양 에는 많이 존재하나 배양상의 어려움을 가지고 있다. 따라서 본 실험의 결과 자생식물의 근권에서 분리된 세균이 방선균문과 프로테오박테리아문에 우점하는 것은 기존의 데이터와 많은 부분 일치함을 알 수 있었다.
- )속이 확인되었다. 또한 Bacillales목에 속하는 Halobacillus (H.)속, Staphylococcus (Staphyl.)속이 확인되었다. 자생식물 L.
- 후)방선균 문은">방선균문은 그람 양성균으로, G+C 함량이 높은 계통으로 Corynebacteriales목과 Micrococcales목이 주로 확인되었다(Table 3). 그람음성균 이면서 본">2). 본 연구 결과로 얻어진 3종의 식물에서 원핵미생물의 분포는 계통학적 분석을 수행하였을 때 크게 4문 19종에 속함을 알 수 있었다(Table 3).
- 본 연구를 바탕으로 3종의 자생식물에서 방선균문(Actinobacteria)과 프로테오박테리아문(Proteobacteria)에 속하는 근권세균이 많이 존재함을 확인 할 수 있었다. 세">4). 세 가지 식물 중에 S. oryzifolium와 L. mauritiana이 근권세균의 다양성 지수가 비슷한 수치로 나왔으며, A. sphathulifolius의 경우 다소 낮은 수치의 다양성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
- )속, I.속, Micrococcus (M.)속이 확인되었고, Flavobacteriales목에 속하는 Joostella (J.)속, Leeuwenhoekiella (L.)속이 확인되었으며, Rhizobiales목에 속하는 Aurantimonas (A.)속과 Oceanospirillales목에 속하는 S.속, Rhodobacterales목에 속하는 P.
- 후)생존하였으며">생존하였으며 I.속에 속하는 균주는 pH9에서 생존이 가능함을 알 수 있었다. 내염성의 정도를 속, Staphyl.속은 9%의 높은 내염도에서도 잘 생존함이 확인되었다.
- 속과 Staphyl.속이 9% 높은 염류에도 생존함이 확인되었다. 자생식물 L.
- 속, J.속이 확인되었으며, Rhizobiales목에 속하는 Mesorhizobium (Mesorhiz.)속, Corynebacteriales목에 속하는 Dietzia (D.)속이 확인되었고, Micrococcales목에 속하는 Arthrobacter (Arthr.)속, Alteromonadales목에 속하는 Idiomarina (Id.)속, 그리고 Bacillales목에 속하는 Bacillus (B.)속과 Staphyl.속이 분리, 동정, 확인되었다(Table 2).
후속연구
- 본 연구에서는 천연기념물 336호로 지정된 독도에서 자생하고 있는 A. sphathulifolius, S. oryzifolium, L. mauritiana의 근권에서 원핵미생물을 분리, 동정을 수행하여 근권세균의 분포 및 다양성을 확인하였으며, 이 연구 결과는 독특한 독도 환경 에서 자생하는 식물인 A. sphathulifolius, S. oryzifolium, L.mauritiana과 근권 미생물 간의 상호작용을 이해하는데 중요한 기초 자료로 활용될 것이 기대된다.
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