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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 청미래덩굴 추출물의 항산화 및 항당뇨 효과 연구를 통해 여러 분야에서 천연 항산화제 및 항당뇨 소재로서의 활용 가능성을 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 백합과에 속하는 덩굴성 관목인 청미래 덩굴 70% 에탄올 추출물과 열수 추출물의 항산화 및 항당뇨에 대한 활성을 연구하였다. 총 폴리페놀 함량 과 플라보노이드 함량 측정, 전자공여능, ABTs 소거능, SOD 유사활성능, xanthine oxidase 저해활성, ACE 저해활성, TBARs 측정, PF값 측정 및 α-glucosidase 와 α-amylase 의 저해활성을 측정하였다.
제안 방법
- 7 mM 2,2-azino-bis(3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.45 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+를 형성시킨 후 ethanol로 희석하여 ABTS+ 100 µL에 농도별(50, 100, 500 μg/mL) 시료 100 µL를 가하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- DPPH용액(Sigma) 60 µL 와 농도별(50, 100, 500μg/mL) 시료를 120 µL씩 넣고 혼합한 후 15분간 방치한 다음 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- SOD 유사활성은 Marklund의 방법(22)을 변형하여 측정 하였다. 농도별(50, 100, 500 μg/mL) 시료용액을 20 µL에 tris-HCl 완충용액(50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.
- Xanthine oxidase 저해활성 측정은 Stirpe와 corte의 방법 (23)을 변형하여 측정하였다. 농도별(50, 100, 500 μg/mL) 시료용액 100 µL에 potassium phosphate 완충용액(0.
- 농도별(50, 100, 500 μg/mL) 시료용액 100 µL에 potassium phosphate 완충용액(0.1 M potassium phosphate buffer, pH 8.0) 600 µL와 xanthine(2 mM)을 녹인 기질액 200 µL를 첨가하고, xanthine oxidase (0.2 U/mL) 100 µL를 가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후1 N HCl 1 mL를 가하여 반응정지를 시키고 반응액중에 생성된 uric acid를 흡광도 292 nm에서 측정하였다.
- 본 실험에 사용된 청미래덩굴은 충북 괴산에서 2012년 봄에 생산 된 건채를 구입하여 에탄올과 열수 추출을 실시하였다. 시료의 에탄올 추출물은 70% 에탄올을 시료의 10배를 첨가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였고, 열수 추출물은 증류수를 시료의 10배를 첨가하여 80℃에서 3시간가량 환류냉각 추출해 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 시료 추출물은 여과지(Whatman No.
- 원심 분리 한 액을 실온에서 10분간 방치 한 후 상등액을 532 nm서 흡광도를 측정하였으며, TBARS 값은 1 mL 반응혼합물에 대해서 생성된 1,1,3,3-tetraethoxy propane(TEP)의 함량을 환산하여 [1-(반응구의 생성량/대조구의 생성량)] ×100 으로 항산화 활성을 나타내었다.
- 1 mL를 첨가하여 발색시켰다. 이때 생성된 p-nitrophenol(PNP)은 400 nm에서 spectro-photometer를 이용하여 측정하였으며, 그 양은 표준물질 p-nitrophenol로 부터 작성한 표준곡선으로부터 구하여 다음의 식으로 저해율을 구하였다.
- 전자공여능(EDA: electron donating abilities)은 Blois의 방법(20)을 변형하여 측정하였다. DPPH용액(Sigma) 60 µL 와 농도별(50, 100, 500μg/mL) 시료를 120 µL씩 넣고 혼합한 후 15분간 방치한 다음 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 즉, 시료 용액 100 µL에 2% AlCl3 ethanol solution 100 µL을 가하여 실온에서 1시간 방치한 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 즉, 시료 용액 50 µL에 2 N Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 50 µL를 가하고 실온에서 3분간 반응시킨 후 0.7 M Na2CO3용액 50 µL를 넣어 실온에서 1시간 방치하고, 700 nm에서 흡광도를 측정한 후, 표준물질인 tannic acid로 미리 작성한 표준곡선의 흡광도 값과 비교하여 폴리페놀 함량을 산출하였다.
- 총 폴리페놀 함량 과 플라보노이드 함량 측정, 전자공여능, ABTs 소거능, SOD 유사활성능, xanthine oxidase 저해활성, ACE 저해활성, TBARs 측정, PF값 측정 및 α-glucosidase 와 α-amylase 의 저해활성을 측정하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 Zhuang 등(19)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 시료 용액 100 µL에 2% AlCl3 ethanol solution 100 µL을 가하여 실온에서 1시간 방치한 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 폴리페놀 정량은 AOAC(18)를 변형하여 정량하였다. 즉, 시료 용액 50 µL에 2 N Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 50 µL를 가하고 실온에서 3분간 반응시킨 후 0.
- 즉, 시료 용액 100 µL에 2% AlCl3 ethanol solution 100 µL을 가하여 실온에서 1시간 방치한 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 quercetin을 사용하였으며, 표준물질의 검량선과 비교하여 총 플라보노이드 함량을 구하였다.
대상 데이터
- Ltd.(Japan)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 청미래덩굴은 충북 괴산에서 2012년 봄에 생산 된 건채를 구입하여 에탄올과 열수 추출을 실시하였다. 시료의 에탄올 추출물은 70% 에탄올을 시료의 10배를 첨가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였고, 열수 추출물은 증류수를 시료의 10배를 첨가하여 80℃에서 3시간가량 환류냉각 추출해 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다.
이론/모형
- α-amylase 저해활성 측정은 agar diffusion 방법(28)을 이용하여 측정하였다.
- ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+ cation decolorization assay 방법(21)에 의하여 측정하였다. 7 mM 2,2-azino-bis(3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.
- ACE 저해효과 측정은 Cushman 등의 방법(24)에 의하여 행하였다. 즉, 반응구는 0.
- PF는 Andarwulan과 Shetty의 방법(26)으로 측정하였다. 10 mg의 β-carotene을 50 mL chloroform에 용해한 용액 1 mL를 evaporator용 수기에 넣고 40℃ water bath에서 chloroform을 증류시킨 후, 20 µL linoleic acid, 184 µL tween 40과 50 mL H2O2를 가하여 emulsion을 만들고, 5 mL emulsion을 농도별(50, 100, 500μg/mL) 시료용액 100 uL에 혼합하여 잘 섞어준 뒤 50℃에서 30분간 반응시켜 냉각시킨 다음, 470 nm에서 흡광도를 측정하였고, PF는 반응구의 흡광도/대조구의 비로 나타내었다.
- 본 실험에 TBARS는 Burge와 Aust의 방법(25)에 따라 측정하였다. 1% linoleic acid와 1% tween-40으로 emulsion 을 만들고 emulsion 0.
- 세포를 α-glucosidase 저해활성을 측정하기 위하여 Tibbot 등의 방법(27)에 따라 반응 혼합액은 50 mM sodium succinate buffer(pH 4.2)에 p-nitrophenol-α-D-glucopyranoside (PNPG)를 용해시켜 1 mg/mL의 농도로 기질을 만들었다.
성능/효과
- 총 폴리페놀 함량 과 플라보노이드 함량 측정, 전자공여능, ABTs 소거능, SOD 유사활성능, xanthine oxidase 저해활성, ACE 저해활성, TBARs 측정, PF값 측정 및 α-glucosidase 와 α-amylase 의 저해활성을 측정하였다. 그 결과 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량은 에탄올 추출물에 함유량이 더 많았으며, 전자공여능, ABTs 소거능, SOD 유사활성능, xanthine oxidase 저해활성, ACE 저해활성, TBARs 측정, PF값 측정 결과 모두 청미래 덩굴 열수 추출물보다 에탄올 추출물의 활성이 우수하였다. 또한 α-glucosidase 와 α-amylase 의 저해활성을 측정한 결과 에탄올 추출물의 활성이 열수 추출물보다 우수하였다.
- 또한 α-glucosidase 와 α-amylase 의 저해활성을 측정한 결과 에탄올 추출물의 활성이 열수 추출물보다 우수하였다.
- 이러한 방법으로 청미래덩굴 에탄올 추출물과 열수 추출물의 SOD 유사활성능을 측정한 결과 Fig. 3과 같이 청미래덩굴 500 µg/mL에서 각각 26.3%, 16.8%의 유사활성능을 확인하였다.
- 청미래덩굴 에탄올 추출물과 열수 추출물은 각각 500 µg/mL에서 75.8%와 73.4%의 소거능이 있음을 확인하였다.
- 청미래덩굴 에탄올 추출물과 열수 추출물의 xanthine oxidase 저해효과를 측정한 결과 Fig. 4와 같이 500 µg/mL에서 55.2%, 32.6%로 청미래덩굴 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 높은 활성을 보였다.
- 청미래덩굴 에탄올 추출물과 열수 추출물이 고혈압의 발생기작에서 ACE저해 작용을 통한 고혈압 억제 활성을 측정한 결과 Fig. 5에서와 같이 청미래덩굴 에탄올 추출물과 열수 추출물은 500 µg/mL에서 각각 69.4%, 48.3%의 저해율을 보였다.
- 이에 tannic acid를 기준 물질로 하여 표준곡선을 그린 후 청미래덩굴 에탄올 및 열수 추출물의 폴리페놀 함량을 측정한 결과 Table 1과같이 나타내었다. 청미래덩굴 에탄올 추출물은 108.4 mg/g, 열수 추출물은 44.6 mg/g으로 청미래덩굴 열수추출물보다 에탄올 추출물에 더 많은 폴리페놀이 함유되어 있음을 확인할 수 있었다. 이는 Chung 등(30)의 구절초의 꽃, 잎 및 줄기, 뿌리 등 부위별 메탄올 추출물이 각각 17.
- 따라서 quercetin을 기준물질로 하여 표준곡선을 그린 후 청미래덩굴 에탄올 추출물과 열수 추출물의 플라보노이드 함량을 측정한 결과 Table 1와 같이 나타내었다. 청미래덩굴 에탄올 추출물은 76.2 mg/g, 열수 추출물은 35.3 mg/g의 함량을 나타내었다. 이는 Lee 등(33)의 환삼덩굴의 메탄올 추출물이 13.
- 청미래덩굴 추출물을 첨가하여 TBARs를 측정한 결과 Fig. 6과 같이 청미래덩굴 에탄올 추출물과 열수 추출물은 500 µg/mL의 농도에서 각각 82.2%, 63.2%의 억제율을 확인하였다.
- 청미래덩굴 추출물의 α-amylase 저해활성을 측정한 결과 Fig. 8(b)와 같이 청미래덩굴 에탄올 추출물과 열수 추출물 500 µg/mL의 농도에서 각각 17.9%, 15.9%의 저해활성을 나타내었다.
- 청미래덩굴 추출물의 α-glucosidase 저해활성을 측정한 결과 Fig. 8(a)와 같이 에탄올 추출물과 열수 추출물은 500 µg/mL의 농도에서 각각 13.6%, 11.2%의 저해활성을 보였다.
- 청미래덩굴의 전자공여능을 측정한 결과 Fig. 1과 같이 에탄올 추출물과 열수 추출물은 각각 500 µg/mL에서 43.5%, 35.1%의 활성을 나타내었다.
후속연구
- 또한 α-glucosidase 와 α-amylase 의 저해활성을 측정한 결과 에탄올 추출물의 활성이 열수 추출물보다 우수하였다. 이상의 검증 결과를 종합하여 볼 때 청미래 덩굴의 에탄올 추출물의 항산화 및 항 당뇨 활성이 우수하였고, 차후 항산화 및 항 당뇨 예방물질 소재로서의 활용이 가능할 것으로 판단된다.
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