[논문]복분자 에탄올 추출물의 항산화 및 항용혈 효능

장태수; 양재찬; 임선영; 김보애

doi:10.12925/jkocs.2014.31.1.130

복분자 에탄올 추출물의 항산화 및 항용혈 효능
Antioxidant and Antihemolytic Activity of Ethanol Extracts of Rubus coreanus Miquel 원문보기

한국유화학회지 = Journal of oil & applied science, v.31 no.1, 2014년, pp.130 - 135

장태수 (서울대학교 그린바이오과학기술연구원) , 양재찬 (목원대학교 테크노과학대학 생의약화장품학부) , 임선영 (서울대학교 그린바이오과학기술연구원) , 김보애 (목원대학교 테크노과학대학 생의약화장품학부)

초록
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천연에서 유래한 항산화 및 항용혈 소재개발을 위해 복분자 에탄올 추출물의 생리활성 효능 평가를 실시하였다. 복분자를 에탄올 추출한 후, 획득한 추출물을 섬유아세포주인 HS68에 처리하여 DPPH 라디칼 소거능과 SOD 유사 항산화 효능을 평가하였다. 또한 Sprague Dawley 렛트 적혈구 세포에 과산화수소로 산화를 유도한 후 추출물의 항용혈 효능을 살펴보았다. 그 결과 추출물은 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능과 SOD 유사 활성이 증가하는 것으로 나타났다. 렛트 적혈구를 이용한 항용혈 평가에서는 과산화수소를 단독으로 처리한 양성대조군보다 추출물을 처리한 군에서 항용혈율이 농도 의존적으로 유의하게 증가하였다. 이들 결과는 복분자 추출물이 항산화효능과 항용혈 약용 식물 소재로서의 가능성을 내는 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

To develop a natural antioxidant and anti-hemolytic agents, we investigated the effects of ethanol extracts of Rubus coreanus Miquel (crude extracts). Crude extract was extracted with ethanol. Antioxidant activity of crude extracts was evaluated by employing two different assays, 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) radical scavenging activity and super oxide dismutase(SOD)-like activity. Also, anti-hemolytic activity of crude extract was determined using $H_2O_2$-induced hemolysis in normal rat red blood cells (RBC) or plasma. The extracts obtained from crude extract dose-dependently increased the scavenging activity on DPPH-induced radicals and SOD-like activity. RBC oxidative hemolysis induced by $H_2O_2$ was significantly suppressed by the extracts of Rubus coreanus Miquel in a dose-dependent manner. These results suggest that crude extracts may have value as the potential antioxidant and anti-hemolytic medicinal plant.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

복분자의 주요제품인 과실주의 소비가 크게 감소하여 다양한 제품개발이 시도되고 있으나 단순 가공 수준의 제품만이 제시되고 있어 과다 생산되는 복분자의 효율적인 활용방안이 아직 미흡한 실정이다[21-23]. 따라서 본 연구에서는 복분자의 항산화 효능과 항용혈 효능을 함께 평가함으로써 적혈구 세포막보호 효능에 대하여 구체화하여 다양한 분야에서 적극적으로 활용될 수 있도록 항산화 기능성소재로서의 가능성을 검증하고자 한다.
본 연구는 복분자를 에탄올 추출한 후 세포생존율, 항산화 효능을 포함한 렛트 적혈구 항용혈율을 평가하여 산화적 물질부터 세포를 보호할 수 있는 천연 기능성 소재로서의 가능성을 평가하였으며 그 결과는 다음과 같다.
그러나 체내 염증반응과 관련된 질환의 경우 활성 산소류가 과다하게 생성되기 때문에 외부로부터 항산화 물질을 보충할 필요가 있다. 본 연구는 항산화물질이 다량 포함되어 있는 천연소재로서 복분자 추출물을 이용하여 항산화 효능과 적혈구 보호효능을 측정하였다.
항산화 방어 시스템 중에서도 효소에 의한 방어기전은 catalase와 superoxide dismutase등을 대표적으로 들 수 있다[25]. 이에 본 연구에서는 복분자 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능과 SOD 효소 활성에 대하여 측정하였다. DPPH는 보라색을 띄며 화학적으로 안정화된 자유라디칼을 가지고 있는 수용성 물질로 전자를 받게 되면 흡광도가 감소하며, 환원력이 있는 물질과 만나 전자를 내어주면 DPPH 라디칼이 소멸되어 특유의 보라색이 옅은 노란색으로 변하는 것을 측정하게 된다.

제안 방법

100μM H2O2가 함유된 PBS로 반응시킨 것을 100% 용혈을 일으킨 양성대조군으로 하여 항용혈율을 백분율로 환산하였다.
를 처리한 적혈구는 시간 의존적으로 용혈율이 증가하였으며, 1시간 이후에는 100% 용혈되었다. 복분자 추출물 처리에 의한 적혈구 용혈 억제 효과를 평가하기 위해 H₂O₂ 로 산화적 손상을 유도하는 동시에 농도별로 추출물을 포함하여 실험을 수행하였다. 그 결과 Table 1과 같이 복분자 에탄올 추출물을 처리한 군에서 용혈이 억제되는 것으로 나타났으며 농도 의존적으로 항용혈율이 증가하였다.
분리한 적혈구는 0.9% saline phosphate buffer (pH 7.4, Na2HPO4·12H2O 9.6 mM, NaH2PO4·2H2O 1.6mM)로 세척하여 원심분리하고 추출물을 농도별로 가하여 상층액 내의 혈색소(hemoglobin)양을 540 nm 파장에서 spectrophotometer를 이용해 측정하였다.
복분자는 강원도 횡성에서 2013년 7월 생산된 것을 제공 받아 사용하였다. 수확 직후의 복분자를 상온에서 5일 동안 건조하여 분쇄한 뒤 열에 의한 손상으로부터 배제하기 위해 상온 25℃에서 99.5% 에탄올 용매로 하여 추출하였다. 추출물은 4일에 걸쳐 추출되었으며, 분쇄된 원료와 에탄올의 비율은 1:9로 설정한 후 추출하였고, 상층액을 100㎛ filter paper를 이용하여 감압 필터링하였다.
이 후 획득된 추출액을 농축기를 이용하여 45℃의 조건으로 농축하였으며, 최종 동결건조기로 용매 잔류를 최소화한 후 분말형태로 –75℃에 보관하면서 in vitro 실험에 사용하였다.
5% 에탄올 용매로 하여 추출하였다. 추출물은 4일에 걸쳐 추출되었으며, 분쇄된 원료와 에탄올의 비율은 1:9로 설정한 후 추출하였고, 상층액을 100㎛ filter paper를 이용하여 감압 필터링하였다. 이 후 획득된 추출액을 농축기를 이용하여 45℃의 조건으로 농축하였으며, 최종 동결건조기로 용매 잔류를 최소화한 후 분말형태로 –75℃에 보관하면서 in vitro 실험에 사용하였다.
추출물의 DPPH 저해율 활성 측정(Electron do nating abilities, EDA)은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다[24]. 각 시료용액 2.
추출물의 독성을 평가하기 위해 HS68 섬유아세포에 복분자 에탄올 추출물을 농도별로 처리한 다음 24시간 후에 ELISA microplate reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 Fig.

대상 데이터

7주령의 건강한 수컷 SD (Sprague Dawley)렛트를 중앙실험동물(주)로부터 공급받아 사용하였으며, 제공받는 날로부터 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일간 휴식한 후 사용하였다. 렛트는 에테르로 마취시켜 헤파린이 처리된 주사기를 이용하여 심장으로부터 채혈하였다.
인간 섬유아세포주인 HS68 (human skin fibroblast)은 ATCC (Rockville, MD, USA)로부터 분양 받아 사용하였으며, 세포배양을 위한 Dulbecco’s modified Eagel’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및 항생제(penicillin/streptomycin)는 Gibco사 (Grand Island, NY, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. DMEM에 10% FBS, 100 U/㎖ penicillin 및 100 ㎍/㎖ streptomycin을 혼합한 배지를 사용하였고, 37℃, 5% CO₂조건의 incubator에서 배양하였다. 세포배양 배지는 2일마다 새로운 배지로 갈아주었다.
복분자는 강원도 횡성에서 2013년 7월 생산된 것을 제공 받아 사용하였다. 수확 직후의 복분자를 상온에서 5일 동안 건조하여 분쇄한 뒤 열에 의한 손상으로부터 배제하기 위해 상온 25℃에서 99.
인간 섬유아세포주인 HS68 (human skin fibroblast)은 ATCC (Rockville, MD, USA)로부터 분양 받아 사용하였으며, 세포배양을 위한 Dulbecco’s modified Eagel’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및 항생제(penicillin/streptomycin)는 Gibco사 (Grand Island, NY, USA) 제품을 구입하여 사용하였다.

데이터처리

모든 결과는 3회 이상 반복 분석하였으며, 자료는 평균±표준오차(mean±SD)로 나타내었고, 통계학적 분석은 Student's t-test로 행하였으며, 유의성 검증은 대조군과 비교하여 결정하였다.

이론/모형

전자공여 효과는 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. SOD 효소 활성은 SOD assay Kit-WST를 이용하여 지시대로 측정하였다. 96-well plate에 청각 분획물을 넣고 WST-1 (2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, mono-sodium salt)과 xanthine oxidase working solution을 첨가한 후 37℃에서 20분간 incubation한 후 microplate reader에서 450 nm 파장을 측정하였다.

성능/효과

1. 복분자 에탄올 추출물의 세포생존율에 미치는 영향에 대하여 MTT 평가 결과 0.5mg/ml 이상의 농도에서 다소 낮은 세포 생존율을 나타내었다.
2. 복분자 에탄올 추출물을 처리한 경우 농도 의존적으로 DPPH 라디칼에 대한 시료의 환원력이 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, SOD-like activity 또한 농도 의존적으로 증가하였다.
3. 복분자 에탄올 추출물을 H₂O₂를 처리한 양성대조군과 비교해 용혈이 억제되는 것으로 나타났으며 농도 의존적으로 항용혈율이 증가하였다.
그 결과 Fig. 2에서와 같이 복분자 에탄올 추출물의 경우 2, 1mg/ml 농도에서 각각 77.8±4.26, 91.0±2.92%의 세포생존율을 나타내었으며 0.5mg/ml 이상의 농도에서 다소 낮은 세포생존율을 나타내었으나 그 이하의 농도에서는 독성을 나타내지 않아 높은 피부세포 안전성을 나타내는 것으로 평가된다.
복분자 추출물 처리에 의한 적혈구 용혈 억제 효과를 평가하기 위해 H₂O₂ 로 산화적 손상을 유도하는 동시에 농도별로 추출물을 포함하여 실험을 수행하였다. 그 결과 Table 1과 같이 복분자 에탄올 추출물을 처리한 군에서 용혈이 억제되는 것으로 나타났으며 농도 의존적으로 항용혈율이 증가하였다. 기존 연구 의하면 vitamin C와 Quercetin이 강력한 항용혈율 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다[26].
DPPH는 보라색을 띄며 화학적으로 안정화된 자유라디칼을 가지고 있는 수용성 물질로 전자를 받게 되면 흡광도가 감소하며, 환원력이 있는 물질과 만나 전자를 내어주면 DPPH 라디칼이 소멸되어 특유의 보라색이 옅은 노란색으로 변하는 것을 측정하게 된다. 그 결과 추출물을 처리한 경우 농도 의존적으로 DPPH 라디칼에 대한 시료의 환원력이 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, SOD-like activity 또한 농도 의존적으로 증가하였다 (Fig. 1).

후속연구

즉 항용혈 효능을 나타낸다는 것은 적혈구 세포막의 산화적 손상을 억제하는 것으로써 강력한 항산화 효능과 관련된다. 그러므로 이에 대한 결과를 바탕으로 vitamin C와 Quercetin를 양성대조군으로 설정하여 추후 항용혈 효능에 대한 비교 실험을 하여 증명할 필요가 있다고 사료된다.
이상의 결과는 복분자 에탄올 추출물이 세포보호 효능을 나타내는 항산화 기능성 소재로서 식품, 화장품 등의 다양한 사업에 활용될 수 있는 가능성이 충분하다고 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	복분자는 무엇인가?	복분자(Rubus coreanus Miquel)는 장미과(Rosaceae)에 속하는 산딸기(Rubus)의 일종으로 검은 빛의 붉은색 열매를 맺는 다년생 식물이다[14]. 예로부터 약용으로 사용되고 있으며 동의보감(東醫寶鑑)에 의하면 신(身)과 간(肝)을 보호하고 눈을 밝게 하며, 강장, 당뇨, 지혈 등에서 사용된다고 알려져 있다[15].
	동의보감에 따른 복분자의 효능은 무엇인가?	복분자(Rubus coreanus Miquel)는 장미과(Rosaceae)에 속하는 산딸기(Rubus)의 일종으로 검은 빛의 붉은색 열매를 맺는 다년생 식물이다[14]. 예로부터 약용으로 사용되고 있으며 동의보감(東醫寶鑑)에 의하면 신(身)과 간(肝)을 보호하고 눈을 밝게 하며, 강장, 당뇨, 지혈 등에서 사용된다고 알려져 있다[15]. 특히 복분자는 인, 철, 유기산, 비타민 C 등의 유효성분[16]과 생리활성물질의 종류로는 gallic acid, quercetin, ellagic acid 및 다양한 페놀산 등이 있어 인체의 항암작용, 항산화작용, 면역증진 효과가 있다고 알려져 있다[17-20].
	세포막이 산화적 스트레스에 노출되면 어떤 일이 벌어지는가?	적혈구의 세포막에는 불포화 지방산이 다량 포함되어 있으며, 세포질에는 높은 농도의 산소와 헤모글로불린이 함유되어 있어 산화적 손상에 매우 민감하게 반응한다[12,13]. 세포막이 산화적 스트레스에 노출되게 되면 지질과산화(lipid peroxidation)가 생성되며 지질과산화의 최종 생성물로서 malondialdehyde (MDA)가 적혈구에 일시적으로 노출될 경우 세포 구성물과의 높은 반응성으로 적혈구의 세포사멸을 초래한다[13].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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