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문제 정의
- 또한 자외선에 영향을 받은 피부에서 활성산 소에 의해 collagen 단백질을 분해하는 효소인 MMP-1을 분비함으로서, 피부의 주름이 증가하게 된다. 본 연구에서는 아로니아 추출물로 활성산소를 제거하는 능력인 항산화능을 평가하여, 이를 근거로 주름개선에 우수한 효능이 있음을 확인 하였다. 아로니아 속에 항산화능이 뛰어나다고 잘 알려진 안토시아닌류 성분들이 주름개선효과에 지대한 영향을 끼친 것으로 사료되며, 시료들 중에서도 초음파 공정을 통한 아로니아 추출물의 효능이 여타 공정법들 보다도 큰 효능을 보였다.
- 지금까지의 결과를 확인하였을 때 항산화능이 높을수록 주름개선에 효능이 있음을 확인할 수 있었으며, 초음파 공정을 거친 아로니아 시료가 가장 활성이 높은 것을 알 수 있었다. 이에 더하여, 또 다른 주름 개선효능을 알 수 있는 실험으로 collagen 생성을 저해하는 효소인 MMP-1의 생성 실험을 통하여 주름개선효능에 대하여 추가적으로 확인해 보기로 하였다.
제안 방법
- DPPH (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) 자유 라디칼 소거활 성은 Dietz (Dietz et al., 2005)의 방법을 사용하되 실험방법을 변형하여 실험하였다.
- 아로니아 시료의 주름개선에 대한 효능을 알아보기 위하여, collagen 생성능 실험을 진행하였으며, 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 그 결과, 각각의 모든 시료는 5가지의 농도차에 따라 전부 유의차를 보이며 농도 의존적으로 생성량이 증가하는 양상을 보였고, 아로니아 시료의 가장 높은 농도인 1.
- 추출에 사용 된 아로니아 열매는 2013년도 산 충북 단양군 농업기술센터부터 지원받아 사용하였다. 아로니아 시료의 추출은 수직 환류냉각기가 설치되어있는 flask에, 열수추출의 경우 1l의 증류수에 아로니아 열매를 100 g을 사용하여 100℃에서 24시간 추출하였으며, 에탄올 추출물은 같은 조건에서 용매를 70% 에탄올로 하여 60℃에서 24시간 추출하고, 초음파 추출물은 70% 에탄올을 사용하여 추출한 시료에서 초음파 추출기(AUG-R3-900, ASIA ULTRASONIC, Korea)를 통하여, 120 kHz의 초음파에서 30분 추출을 실시하였다. 추출 한 모든 아로니아 시료는 감압여과기를 사용하여 여과하였다.
- 아로니아 추출물의 항산화능을 확인하기 위하여 DPPH 자유라디칼 소거능을 측정하였으며, Table 1에 측정 된 결과를 표시하였다. DPPH는 517 ㎚에서 최대 흡광도를 나타내고, 환원을 하게 되면 517㎚ 에서 흡광도가 감소한다 .
- 추출 한 모든 아로니아 시료는 감압여과기를 사용하여 여과하였다. 여과 후에 회전식 감압농축기 (EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Japan)로 농축한 후, 동결건조기 (PVTFA 10AT, ILSIN, Korea)에 72시간동안 동결 건조하여 분말로 만들어 실험을 진행하였다.
- , 2005)의 방법을 사용하되 실험방법을 변형하여 실험하였다. 용매를 methanol로 제조한 0.1 mM DPPH용액 150㎕ 을 첨가 후 각 공정 별 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0㎎/㎖ 농도의 아로니아 시료 150㎕을 혼합하여 25℃에서 30분 동안 암실에 방치한 후 517㎚의 파장에서 흡광도 측정하였다. 측정한 값은 DPPH radical scavenging activity(%)로 나타내었다.
- , 2013), 마찬가지로 세포독성은 높지 않았다. 이를 이용하여 HDF(Human Dermal Fibroblasts)인 CCD-986sk를 통해 피부의 탄력을 유지하는 collagen 단백질 및 collagen 단백질을 저해하여 피부의 주름증가에 원인이 되는 효소 MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1)의 생성량에 대한 실험을 진행하여 아로니아 시료에 대한 주름개선효과를 확인하여 각 추출별로 결과 값을 비교하였다.
- 이와 같은 근거에 초점을 두어 본 연구에서 아로니아의 주름개선 효능을 평가하였으며, 열수 추출물, 에탄올 추출물, 초음파 공정을 거친 에탄올 추출물 총 세 가지 공정에 관하여 활성을 비교하였다.
- 이와 같이 아로니아는 항산화능이 뛰어나 주름개선에 효능이 있을 것으로 판단하여, 본 연구진은 아로니아가 가지는 높은 항산화능에 의한 주름개선효능에 대한 활성을 확인하기 위하여 연구를 진행하였으며, 아로니아 추출물의 주름개선을 평가 함에 있어 열수 추출, 에탄올 추출, 초음파 공정을 거친 에탄올 추출물 총 세가지의 추출방법을 비교하여 실험을 진행하였다. 열수 추출과 에탄올 추출은 고온에서 추출을 진행하므로, 아로니아의 활성물질이 온도의 영향으로 인하여 변성 될 가능성이 있다 (Park et al.
- , 1995). 이와 관련하여 주름개선에는 항산화능이 큰 영향을 끼친다는 것에 착안하여, 항산화능이 뛰어난 것으로 잘 알려진 아로니아 추출물을 이용하여 주름개선 실험을 진행하였다.
- 주름개선 활성 평가를 하기 전 실험으로 정상세포에 대한 독성을 알아보기 위해 섬유아세포인 CCD-986sk 세포를 이용하여 세포 독성을 확인한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 그 결과 아로니아 시료 중 독성이 가장 높은 추출물은 초음파 공정을 이용한 아로니아 추출물로 독성이 14.
- 아로니아 시료의 추출은 수직 환류냉각기가 설치되어있는 flask에, 열수추출의 경우 1l의 증류수에 아로니아 열매를 100 g을 사용하여 100℃에서 24시간 추출하였으며, 에탄올 추출물은 같은 조건에서 용매를 70% 에탄올로 하여 60℃에서 24시간 추출하고, 초음파 추출물은 70% 에탄올을 사용하여 추출한 시료에서 초음파 추출기(AUG-R3-900, ASIA ULTRASONIC, Korea)를 통하여, 120 kHz의 초음파에서 30분 추출을 실시하였다. 추출 한 모든 아로니아 시료는 감압여과기를 사용하여 여과하였다. 여과 후에 회전식 감압농축기 (EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co.
- 이와 같은 결과를 보았을 때, 아로니아 시료들은 전반적으로 항산화능이 높았으며 그 중에서도 초음파공정을 거친 아로니아 시료가 활성이 가장 좋았음을 알 수 있었다. 항산화능이 높으면 활성산소를 감소시켜 피부의 항 주름의 효능을 확인한 선행연구를 바탕으로 하여(Jang et al., 2013), 아로니아 시료를 이용하여, 피부의 탄력을 유지시켜주는 단백질인 collagen 생성능에 대한 실험으로 주름개선효능에 대한 평가를 진행하였다.
대상 데이터
- HDF (Human dermal fibroblasts)는 CCD-986sk으로 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 동결 된 것으로 구입하였다. 구입한 CCD-986sk은 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
- HDF세포는 CCD-986sk를 이용하였으며, collagen 생성능 측정은 Procollagen Type I C-peptide (PIP) EIA Kit (Takara, Otsu, Japan) 을 사용하여 실험을 진행하였다. 키트에 준비 된 plate에 Antibody-POD Conjugate Solution을 100㎕ 넣고, 아로니아 샘플을 농도별로 20㎕ 를 첨가한다.
- MTT용액은 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich, USA) 시약을 사용하였다. 독성 평가에는 HDF세포인 CCD-986sk를 사용하였으며, 세포를 3.
- HDF (Human dermal fibroblasts)는 CCD-986sk으로 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 동결 된 것으로 구입하였다. 구입한 CCD-986sk은 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 그 외 사용된 모든 시약들은 Sigma-Aldrich (St.
- 구입한 CCD-986sk은 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 그 외 사용된 모든 시약들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)을 통하여 구입, 사용하였다.
- 독성 평가에는 HDF세포인 CCD-986sk를 사용하였으며, 세포를 3.0 × 106 cells/well 농도로 96-well plate에 주입한 뒤 24시간 동안 세포를 부착하였다.
- 추출에 사용 된 아로니아 열매는 2013년도 산 충북 단양군 농업기술센터부터 지원받아 사용하였다. 아로니아 시료의 추출은 수직 환류냉각기가 설치되어있는 flask에, 열수추출의 경우 1l의 증류수에 아로니아 열매를 100 g을 사용하여 100℃에서 24시간 추출하였으며, 에탄올 추출물은 같은 조건에서 용매를 70% 에탄올로 하여 60℃에서 24시간 추출하고, 초음파 추출물은 70% 에탄올을 사용하여 추출한 시료에서 초음파 추출기(AUG-R3-900, ASIA ULTRASONIC, Korea)를 통하여, 120 kHz의 초음파에서 30분 추출을 실시하였다.
데이터처리
- 모든 실험의 데이터 통계처리는 3회 반복하였으며, 실험값의 통계는 SAS (Statistical Analysis System) 프로그램을 통하여 two-way ANOVA 방법으로 처리하였다. 처리구간의 최소 유의 수준의 차는 p < 0.
성능/효과
- 5pg/㎖ 로 가장 낮은 MMP-1의 생성량을 확인하였다. MMP-1의 생성량이 열수 추출물, 에탄올 추출물, 초음파 공정을 거친 에탄올 추출물 순으로 모두 유의적인 차이를 보이며 낮게 나타났으며, 주름개선에는 역순으로 효능이 뛰어남을 확인하였다. 주름개선효능이 뛰어나다고 알려진 황철나무, 산수유, 구기자의 초임계 추출물의 연구와 비교하였을 때 (Shin et al.
- 3%로 WE와 유의적인 차이가 없었다. 가장 높은 소거활성을 보인 초음파 공정을 거친 에탄올 추출물 (UEE)의 경우에는 90.4%로 기타 다른 추출법에 비해 유의적인 차이를 보였으며 농도차가 있긴 하나, 양성대조군인 ascorbic acid 보다도 높은 항산화능을 나타내었다. 농도가 증가함에 따라 DPPH 소거능이 증가하였다.
- 1에 나타내었다. 그 결과 아로니아 시료 중 독성이 가장 높은 추출물은 초음파 공정을 이용한 아로니아 추출물로 독성이 14.62%인 것으로 측정 되었다. 이 측정된 결과 값은 앞으로의 세포실험을 진행하는데 있어 아로니아 시료에 대한 세포독성이 실험에 큰 영향을 끼칠 만큼 높지 않은 것으로 판단하였다.
- 2에 나타내었다. 그 결과, 각각의 모든 시료는 5가지의 농도차에 따라 전부 유의차를 보이며 농도 의존적으로 생성량이 증가하는 양상을 보였고, 아로니아 시료의 가장 높은 농도인 1.0㎎/㎖의 농도에서 열수 추출물은 53.5ng/㎖의 collagen이 생성되었으며, 70% 에탄올 초음파의 collagen 생성량은 224.4ng/㎖, 초음파 공정을 이용한 에탄올 초음파는 245ng/㎖로 다른 아로니아 시료들과 비교하였을 때 가장 높은 생성량을 확인하였다. 열수 추출물, 에탄올 추출물, 초음파 공정을 거친 에탄올 추출물 서로간의 충분한 유의차를 보였다.
- 아로니아 추출물의 농도가 10배가 더 높긴하나 MMP-1의 생성량이 1000배 이상 낮은 것으로 보아 아로니아 추출물이 MMP-1의 생성량 저해에 활성이 더 좋은 것을 알 수 있었으며, 주름개선에 뛰어난 효능이 있음을 알 수 있었다. 또한, collagen 생성 실험결과와 마찬가지로 항산화능이 뛰어날 수록 MMP-1에 대한 저해활성도 좋은 것으로 판단 되었으며, 초음파 공정을 이용한 추출물이 여타 공정법들보다 활성이 가장 뛰어나, 주름개선효능에 가장 좋은 것을 확인할 수 있었다.
- 3에 표시하였다. 모든 샘플이 농도에 따라 유의적인 차이를 보이며 MMP-1의 생성량이 감소하는 양상을 확인하였다. 아로니아 시료의 가장 높은 농도인 1.
- 아로니아 속에 항산화능이 뛰어나다고 잘 알려진 안토시아닌류 성분들이 주름개선효과에 지대한 영향을 끼친 것으로 사료되며, 시료들 중에서도 초음파 공정을 통한 아로니아 추출물의 효능이 여타 공정법들 보다도 큰 효능을 보였다. 아로니아 속 성분물질인 안토시아닌 및 기타 활성물질이 저온을 통한 초음파 공정으로 인하여, 다른 공정 법보다 활성물질의 변성 및 파괴가 적어 성분물질의 보존 및 용출이 잘 되어 뛰어난 효능을 보인 것을 알 수 있었다. 이를 통하여 초음파 공정을 거친 아로니아 시료의 주름개선효능의 증진을 확인하였으며, 아로니아의 향장소재로서 가능성을 입증하였다.
- 본 연구에서는 아로니아 추출물로 활성산소를 제거하는 능력인 항산화능을 평가하여, 이를 근거로 주름개선에 우수한 효능이 있음을 확인 하였다. 아로니아 속에 항산화능이 뛰어나다고 잘 알려진 안토시아닌류 성분들이 주름개선효과에 지대한 영향을 끼친 것으로 사료되며, 시료들 중에서도 초음파 공정을 통한 아로니아 추출물의 효능이 여타 공정법들 보다도 큰 효능을 보였다. 아로니아 속 성분물질인 안토시아닌 및 기타 활성물질이 저온을 통한 초음파 공정으로 인하여, 다른 공정 법보다 활성물질의 변성 및 파괴가 적어 성분물질의 보존 및 용출이 잘 되어 뛰어난 효능을 보인 것을 알 수 있었다.
- 아로니아 시료와 대표적인 항산화물질로 알려진 ascorbic acid을 비교해 보았을 때 양성대조군인 ascorbic acid는 0.2㎎/㎖의 농도에서 88.2%의 DPPH 자유라디칼 소거능을 보였으며, 아로니아 시료 1.0㎎/㎖의 농도에서 열수 추출물 (WE)의 경우 84.2%의 자유라디칼 소거능을 나타내었고, 70% 에탄올 추출물 (EE)은 84.3%로 WE와 유의적인 차이가 없었다. 가장 높은 소거활성을 보인 초음파 공정을 거친 에탄올 추출물 (UEE)의 경우에는 90.
- 모든 샘플이 농도에 따라 유의적인 차이를 보이며 MMP-1의 생성량이 감소하는 양상을 확인하였다. 아로니아 시료의 가장 높은 농도인 1.0㎎/㎖ 에서 아로니아 열수 추출물은 102.3pg/㎖의 생성량을 확인하였으며 70% 에탄올 추출물은 34.6pg/㎖의 생성량으로 열수 추출물의 MMP-1 생성량 보다도 큰 유의적인 차이를 보였다. 초음파 공정을 거친 70% 에탄올 추출물은 22.
- 1㎎/㎖에서 20 ~ 35ng/㎖의 MMP-1의 생성량이 측정되었다. 아로니아 추출물의 농도가 10배가 더 높긴하나 MMP-1의 생성량이 1000배 이상 낮은 것으로 보아 아로니아 추출물이 MMP-1의 생성량 저해에 활성이 더 좋은 것을 알 수 있었으며, 주름개선에 뛰어난 효능이 있음을 알 수 있었다. 또한, collagen 생성 실험결과와 마찬가지로 항산화능이 뛰어날 수록 MMP-1에 대한 저해활성도 좋은 것으로 판단 되었으며, 초음파 공정을 이용한 추출물이 여타 공정법들보다 활성이 가장 뛰어나, 주름개선효능에 가장 좋은 것을 확인할 수 있었다.
- 4ng/㎖, 초음파 공정을 이용한 에탄올 초음파는 245ng/㎖로 다른 아로니아 시료들과 비교하였을 때 가장 높은 생성량을 확인하였다. 열수 추출물, 에탄올 추출물, 초음파 공정을 거친 에탄올 추출물 서로간의 충분한 유의차를 보였다. 주름개선에 효능이 있다고 보고 된 포도와 오이즙액을 이용한 동충하초 균사체 연구와 비교하였을 때 동충하초 균사체의 경우 150 ~ 200ng/㎖의 collagen이 생성되는 것으로 보아 아로니아 추출물의 주름개선 효능이 우수함을 확인하였으며(Lee et al.
- 아로니아 속 성분물질인 안토시아닌 및 기타 활성물질이 저온을 통한 초음파 공정으로 인하여, 다른 공정 법보다 활성물질의 변성 및 파괴가 적어 성분물질의 보존 및 용출이 잘 되어 뛰어난 효능을 보인 것을 알 수 있었다. 이를 통하여 초음파 공정을 거친 아로니아 시료의 주름개선효능의 증진을 확인하였으며, 아로니아의 향장소재로서 가능성을 입증하였다.
- 농도가 증가함에 따라 DPPH 소거능이 증가하였다. 이와 같은 결과를 보았을 때, 아로니아 시료들은 전반적으로 항산화능이 높았으며 그 중에서도 초음파공정을 거친 아로니아 시료가 활성이 가장 좋았음을 알 수 있었다. 항산화능이 높으면 활성산소를 감소시켜 피부의 항 주름의 효능을 확인한 선행연구를 바탕으로 하여(Jang et al.
- 열수 추출물, 에탄올 추출물, 초음파 공정을 거친 에탄올 추출물 서로간의 충분한 유의차를 보였다. 주름개선에 효능이 있다고 보고 된 포도와 오이즙액을 이용한 동충하초 균사체 연구와 비교하였을 때 동충하초 균사체의 경우 150 ~ 200ng/㎖의 collagen이 생성되는 것으로 보아 아로니아 추출물의 주름개선 효능이 우수함을 확인하였으며(Lee et al., 2006), 또한 같은 용매의 추출물이더라도 초음파 공정을 이용하였을 때 아로니아 시료의 주름개선 효능이 증가하였음을 알 수 있었다. 이는 앞서 실험한 항산화능을 알아보는 DPPH 실험과 비교하였을때, 초음파 공정을 거친 시료가 항산화능이 가장 높은 결과를 나타낸 것과 같은 양상을 보였다.
- 이는 앞서 실험한 항산화능을 알아보는 DPPH 실험과 비교하였을때, 초음파 공정을 거친 시료가 항산화능이 가장 높은 결과를 나타낸 것과 같은 양상을 보였다. 지금까지의 결과를 확인하였을 때 항산화능이 높을수록 주름개선에 효능이 있음을 확인할 수 있었으며, 초음파 공정을 거친 아로니아 시료가 가장 활성이 높은 것을 알 수 있었다. 이에 더하여, 또 다른 주름 개선효능을 알 수 있는 실험으로 collagen 생성을 저해하는 효소인 MMP-1의 생성 실험을 통하여 주름개선효능에 대하여 추가적으로 확인해 보기로 하였다.
- 6pg/㎖의 생성량으로 열수 추출물의 MMP-1 생성량 보다도 큰 유의적인 차이를 보였다. 초음파 공정을 거친 70% 에탄올 추출물은 22.5pg/㎖ 로 가장 낮은 MMP-1의 생성량을 확인하였다. MMP-1의 생성량이 열수 추출물, 에탄올 추출물, 초음파 공정을 거친 에탄올 추출물 순으로 모두 유의적인 차이를 보이며 낮게 나타났으며, 주름개선에는 역순으로 효능이 뛰어남을 확인하였다.
후속연구
- , 2001; Vinatoru, 2001). 또한, 안토시아닌이 함량 된 라즈베리 추출물에 초음파 처리를 하여 안토시아닌의 양 및 항산화 효능의 증진에 대한 선행 연구를 바탕으로 아로니아에도 안토시아닌의 함량이 풍부하여, 초음파로 인하여 성분 추출 및 항산화 효능 증대에 영향을 미칠 것으로 사료 된다. (Amir et al.
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