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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 미세조류로부터 MAAs 물질 중 Shinorine을 분리정제 하고 이를 이용하여 UV에 의한 인간 피부세포 손상을 방지함으로 자외선 차단용 화장품 소재로써 가능성을 연구하고자 하였다.
제안 방법
- 개의 세포를 분주하여 배양하였다. 24시간 후 FBS를 포함하지 않는 배지로 교체하고 24시간동안 starvation하고, 시료를 농도별로 처리하였다. 그 후 UVA(330-340nm) 조사 (10mJ/cm2)하여 24시간동안 배양하였다.
- 의 UVB를 조사하여 주름을 유도하였다. 24시간동안 추가 배양한 후 FastLane cell one-step buffer set (Qiagen)를 사용하여 RNA를 추출하고 이를 template으로 하여 2X Quantitect SYBR green RT-PCR master mix kit(Qiagen) 매뉴얼에 따라 Rotor gene Q real-time PCR machine(Qiagen)으로 진행하였다. 그 결과는 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)의 gene 발현양으로 normalization 하였다.
- 의 UVB를 조사하여 염증을 유도하였다. 4시간동안 추가 배양한 후 FastLane cell one-step buffer set(Qiagen)를 사용하여 RNA를 추출하고 이를 template으로 하여 2X Quantitect SYBR green RT-PCR master mix kit(Qiagen) 매뉴얼에 따라 Rotor gene Q real-time PCR machine(Qiagen)으로 진행하였다. 그 결과는 glyceraldehyde 3-phosphate
- CCD986sk를 96 well plate에 5×10⁴개의 세포를 분주하여 배양하고, 80% 이상의 confluence가 되면 DMEM 배지로 교환 후 시료를 농도별로 처리하고 15mJ/cm2의 UVB를 조사하여 주름을 유도하였다.
- HaCaT을 96 well plate에 5×10⁴개의 세포를 분주하여 배양하고, 80% 이상의 confluence가 되면 배지를 제거한 다음 DMEM 배지로 교환하고 시료를 농도별로 처리한 후 50mJ/cm2의 UVB를 조사하여 염증을 유도하였다.
- SH의 전처리가 UV에 의해 유도되는 주름관련 유전자 발현 활성을 통해 주름개선 효과를 보이는지 확인하기위해 인간섬유아세포에 SH를 농도별로 처리한 후 UVB를 조사하여 주름과 관련된 PCOLCE의 mRNA level를 비교하였다. 그 결과를 Fig.
- UV protection 효과를 보인 SH 전처리가 UV 조사에 의해 유도된 염증 관련 유전자인 COX-2의 발현에 어떠한 영향이 있는지 real-time PCR을 이용하여 mRNA level에서 확인하였다. Fig.
- 양성대조군으로 5μM hydrocortisone을 처리하였다. UVB를 조사하기 전에 SH를 농도별로 처리하여 UV protection에 의한 COX-2의 발현을 확인하였다. 그 결과 처리한 농도가 증가할수록 COX-2의 발현이 감소하는 경향을 보였다.
- dehydrogenase(GAPDH)의 gene 발현양으로 normalization 하였다. 양성대조군으로 hydrocortisone을 사용하였다.
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4시간동안 추가 배양한 후 FastLane cell one-step buffer set(Qiagen)를 사용하여 RNA를 추출하고 이를 template으로 하여 2X Quantitect SYBR green RT-PCR master mix kit(Qiagen) 매뉴얼에 따라 Rotor gene Q real-time PCR machine(Qiagen)으로 진행하였다. 그 결과는 glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase(GAPDH)의 gene 발현양으로 normalization 하였다
. 양성대조군으로 hydrocortisone을 사용하였다. - 는 BBM(Bold's Basal Medium)배지에서 온도 25℃, 광량 60 μE/m/s, 12:12 LD의 광주기로 배양하였고, 200-300ml의 접종으로 시작해서 3L, 10L, 20L까지 대량배양하고, Fig. 1의 과정을 거쳐 분리하고 정제하였다.
- Chlamydomonas hedleyi.로부터 분리정제 된 SH를 HPLC를 사용하여 순도를 높여 분리정제 하였다.
- Chlamydomonas hedleyi.로부터 자외선 흡수능을 지닌 추출 분획물을 분리·정제하여, 피부세포에서 SH의 자외선 흡수능에 의한 UV protection 효과를 연구하였다. 그 결과 인간 각질형성세포주인 HaCaT cell에 SH를 전처리하고 UVA를 조사하였을 때 UV에 의해 발생되는 세포손상이 감소함을 확인하였다.
- 미세조류 Chlamydomonas hedleyi. 배양하여 분리 정제한 SH를 ESI-MS/MS를 이용하여 확인하였다. Fig.
- 분리 정제한 SH의 자외선 흡수능을 통한 세포손상을 방지하는지를 확인하고자 MTT assay를 이용하여 실험하였다. 인간 각질형성세포주인 HaCaT에 MAA 물질인 SH를 처리하고 UVA를 조사하여 cell viability를 확인하였다.
- 양성대조군으로 5μM hydrocortisone을 처리하였다.
- 1mg/ml 농도로 처리한 실험군에서 약 41% 정도 COX-2의 발현이 감소하였다. 이를 통해 SH에 의한 UV protection 효과를 확인하였다.
- 05mg/ml 농도로 처리하였을 때 대조군보다 PCOLCE mRNA 발현이 상대적으로 증가하였다. 이를 통해 SH에 의해 UV protection을 확인하였다.
- 분리 정제한 SH의 자외선 흡수능을 통한 세포손상을 방지하는지를 확인하고자 MTT assay를 이용하여 실험하였다. 인간 각질형성세포주인 HaCaT에 MAA 물질인 SH를 처리하고 UVA를 조사하여 cell viability를 확인하였다. Fig.
- 45μm membrane filter를 사용하여 필터하였다. 준비된 샘플은 AB SCIEX 3200 QTRAP MS/MS (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 기기의 ESI-MS/MS system을 사용하여 Positive mode에서 Product Ion(MS2) Scan으로 분석하였다.
대상 데이터
- Waters 1525μ Binary HPLC pump, Waters 996 photodiode array detector를 사용하였고 분리정제를 위해 Gemini 5μ C18 110 A(5μm, 4.6 × 250nm, Phenomenex) column을 사용하였다.
- 6 × 250nm, Phenomenex) column을 사용하였다. 분석을 위한 용매는 0.1% trifluoroacetic acid(TFA)를 포함한 water(용매A)와 acetonitrile(용매B)를 사용하였고 1ml/min의 유속으로 332nm 파장에서 검출하였다.
- dehydrogenase(GAPDH)의 gene 발현양으로 normalization 하였다. 양성대조군으로 hydrocortisone을 사용하였다. 실험에 사용한 primer는 Quantitect primer assays(Qiagen)를 사용하였다[11,16].
- 인간 각질형성 세포주(HaCaT, keratinocyte), 인간 섬유아세포(CCD986sk, fibroblast)를 DMEM, 10% FBS, 1% antibiotic-antimycotic(GIBCO)의 배지에서 dish에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다.
이론/모형
- 양성대조군으로 hydrocortisone을 사용하였다. 실험에 사용한 primer는 Quantitect primer assays(Qiagen)를 사용하였다[11,16].
- 그 결과는 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)의 gene 발현양으로 normalization 하였다. 실험에 사용한 primer는 Quantitect primer assays(Qiagen)를 사용하였다[17,18].
성능/효과
- 인간 각질형성세포주인 HaCaT에 MAA 물질인 SH를 처리하고 UVA를 조사하여 cell viability를 확인하였다. Fig. 4의 결과를 보면 자외선 흡수능 가진 SH를 처리한 실험군이 대조군에 비해 cell viability가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. SH의 농도가 증가할수록 cell viability가 증가하는 경향을 보이고 특히 0.
- 4의 결과를 보면 자외선 흡수능 가진 SH를 처리한 실험군이 대조군에 비해 cell viability가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. SH의 농도가 증가할수록 cell viability가 증가하는 경향을 보이고 특히 0.1mg/ml의 농도로 처리한 실험군은 약 10% 정도 증가하였다. 이 결과를 통해 처리한 SH가 피부세포에서 UV protection 효과가 있음을 확인하였다.
- 6에 나타냈다. UV를 조사하였을 때 PCOLCE mRNA의 상대적인 발현이 대조군에 비해 감소하는 것을 확인하였다. 이때 SH를 전처리한 실험군에서 0.
- 로부터 자외선 흡수능을 지닌 추출 분획물을 분리·정제하여, 피부세포에서 SH의 자외선 흡수능에 의한 UV protection 효과를 연구하였다. 그 결과 인간 각질형성세포주인 HaCaT cell에 SH를 전처리하고 UVA를 조사하였을 때 UV에 의해 발생되는 세포손상이 감소함을 확인하였다. 특히 UV에 의해 유도되는 염증관련 유전자인 COX-2의 발현을 감소시킴으로 항염증효과를 관찰할 수 있었다.
- UVB를 조사하기 전에 SH를 농도별로 처리하여 UV protection에 의한 COX-2의 발현을 확인하였다. 그 결과 처리한 농도가 증가할수록 COX-2의 발현이 감소하는 경향을 보였다. 특히 0.
- 특히 UV에 의해 유도되는 염증관련 유전자인 COX-2의 발현을 감소시킴으로 항염증효과를 관찰할 수 있었다. 또한 UV 조사에 의해 유도되는 주름형성과 관련하여 SH처리를 통하여 PCOLCE의 발현을 증가시킴으로 주름개선 효과를 확인하였다. 이러한 결과가 SH의 UV 흡수에 의한 효과인지 SH 자체가 PCOLCE 합성 촉진능을 가지는지가 명확하지 않기에 차후에 추가적인 연구를 통해 SH의 효능을 연구를 진행할 예정이다.
- 또한 미세조류로부터 분리정제한 수용추출물을 HPLC로 분석하여 SH의 retention time이 4.395분으로 나타났고, SH가 수용추출물의 주요한 MAA임을 확인하였다[Fig. 3].
- 1mg/ml의 농도로 처리한 실험군은 약 10% 정도 증가하였다. 이 결과를 통해 처리한 SH가 피부세포에서 UV protection 효과가 있음을 확인하였다.
- 그 결과 인간 각질형성세포주인 HaCaT cell에 SH를 전처리하고 UVA를 조사하였을 때 UV에 의해 발생되는 세포손상이 감소함을 확인하였다. 특히 UV에 의해 유도되는 염증관련 유전자인 COX-2의 발현을 감소시킴으로 항염증효과를 관찰할 수 있었다. 또한 UV 조사에 의해 유도되는 주름형성과 관련하여 SH처리를 통하여 PCOLCE의 발현을 증가시킴으로 주름개선 효과를 확인하였다.
후속연구
- 또한 UV 조사에 의해 유도되는 주름형성과 관련하여 SH처리를 통하여 PCOLCE의 발현을 증가시킴으로 주름개선 효과를 확인하였다. 이러한 결과가 SH의 UV 흡수에 의한 효과인지 SH 자체가 PCOLCE 합성 촉진능을 가지는지가 명확하지 않기에 차후에 추가적인 연구를 통해 SH의 효능을 연구를 진행할 예정이다. 이러한 우수한 UV protection 효과를 보이는 미세조류 자원에서 추출한 SH를 활용하여 자외선 흡수능을 지닌 자연친화적이고 친환경적인 신소재 개발함으로 다양한 자외선 차단 제품 및 항노화 관련 제품 보급에 기여할 것이다.
- 이러한 결과가 SH의 UV 흡수에 의한 효과인지 SH 자체가 PCOLCE 합성 촉진능을 가지는지가 명확하지 않기에 차후에 추가적인 연구를 통해 SH의 효능을 연구를 진행할 예정이다. 이러한 우수한 UV protection 효과를 보이는 미세조류 자원에서 추출한 SH를 활용하여 자외선 흡수능을 지닌 자연친화적이고 친환경적인 신소재 개발함으로 다양한 자외선 차단 제품 및 항노화 관련 제품 보급에 기여할 것이다.
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