형질전환 미세조류의 고주파 처리 배양을 통한 MAA 생산량 증가 Production Yield Enhancement of Mycosporine-like amino acid(MAA)s in Transformed Microalgae Culture by Radiofrequency원문보기
Mycosporine-like 아미노산(MAAs)은 UV 흡수물질이며, 다양한 해양생물들은 MAAs의 합성과 축적을 통하여 환경자외선의 직 간접적인 영향을 감소시키는 기능을 진화시켜 왔다. 이 연구에서는 미세조류, Chlamydomonas hedleyi에 포도당 전달 단백질인 Glucose transporter 1(Glut-1) 유전자를 pCAM1303 벡터에 도입한 형질전환체를 제작하여, 형질전환체의 바이오매스를 최대로 증가시킬 수 있는 최적의 Glucose 농도와 NH4Cl농도를 결정하고, 고주파(Radiofrequency) 발생장치를 활용한 바이오매스 증가와 함께 MAA를 대량 생산할 수 있는 배양 조건을 확립하였다. 연구결과 고주파 처리를 통한 형질전환 미세조류는 4.13 mg/L(MAAs/DCW)으로 3.23 mg/L(MAAs/DCW)의 고주파 처리 없이 배양한 형질전환체보다 효율이 증가하였다. 이러한 결과는 자외선 A 흡수물질을 인위적으로 증폭시킬 수 있어서, 대량배양한 후 MAAs물질을 분리 및 정제하여 피부자극성이 없는 친환경적인 자외선 차단 화장품 산업화에 크게 기여할 수 있음을 의미한다.
Mycosporine-like 아미노산(MAAs)은 UV 흡수물질이며, 다양한 해양생물들은 MAAs의 합성과 축적을 통하여 환경자외선의 직 간접적인 영향을 감소시키는 기능을 진화시켜 왔다. 이 연구에서는 미세조류, Chlamydomonas hedleyi에 포도당 전달 단백질인 Glucose transporter 1(Glut-1) 유전자를 pCAM1303 벡터에 도입한 형질전환체를 제작하여, 형질전환체의 바이오매스를 최대로 증가시킬 수 있는 최적의 Glucose 농도와 NH4Cl농도를 결정하고, 고주파(Radiofrequency) 발생장치를 활용한 바이오매스 증가와 함께 MAA를 대량 생산할 수 있는 배양 조건을 확립하였다. 연구결과 고주파 처리를 통한 형질전환 미세조류는 4.13 mg/L(MAAs/DCW)으로 3.23 mg/L(MAAs/DCW)의 고주파 처리 없이 배양한 형질전환체보다 효율이 증가하였다. 이러한 결과는 자외선 A 흡수물질을 인위적으로 증폭시킬 수 있어서, 대량배양한 후 MAAs물질을 분리 및 정제하여 피부자극성이 없는 친환경적인 자외선 차단 화장품 산업화에 크게 기여할 수 있음을 의미한다.
In sea water, microalgae are exposed to a range of critical environmental conditions. Microalgae are protected from UV-A radiation due to the presence of mycosporine like amino acids(MAAs). Owing to the UV-A absorption properties of MAAs, they are used widely as a UV protecting ingredient in cosmeti...
In sea water, microalgae are exposed to a range of critical environmental conditions. Microalgae are protected from UV-A radiation due to the presence of mycosporine like amino acids(MAAs). Owing to the UV-A absorption properties of MAAs, they are used widely as a UV protecting ingredient in cosmetics. Therefore, there is a need to increase the production yield of MAAs. This study investigated the production yield of MAAs in transformed microalgae by radiofrequency(RF) exposure. Initially, the Glut-1 gene was transformed to Chlamydomonas hedleyi microalgae as a glucose transporter. The biomass was enhanced after Glut-1 gene transformation. In addition, the MAAs production yield was increased during large scale production in bioreactors due to the RF treatment. Therefore, purified extracts of MAAs can be used as a sun block material in the cosmetic industrial field.
In sea water, microalgae are exposed to a range of critical environmental conditions. Microalgae are protected from UV-A radiation due to the presence of mycosporine like amino acids(MAAs). Owing to the UV-A absorption properties of MAAs, they are used widely as a UV protecting ingredient in cosmetics. Therefore, there is a need to increase the production yield of MAAs. This study investigated the production yield of MAAs in transformed microalgae by radiofrequency(RF) exposure. Initially, the Glut-1 gene was transformed to Chlamydomonas hedleyi microalgae as a glucose transporter. The biomass was enhanced after Glut-1 gene transformation. In addition, the MAAs production yield was increased during large scale production in bioreactors due to the RF treatment. Therefore, purified extracts of MAAs can be used as a sun block material in the cosmetic industrial field.
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문제 정의
따라서, 미세조류 Chlamydomonas hedleyi 에 포도당 전달(Glucose transporter) 유전자인 Glut-1을 도입한 형질전환체를 이용하여 최대의 바이오매스로 증가시킬 수 있는 Glucose 및 NH4Cl 농도를 확립한 후, 고주파발생장치를 활용한 생산비가 절감된 MAAs 대량생산방법으로 자연친화적이며 친환경적인 피부자극을 보이지 않는 자외선 차단 화장품 원료 소재로 산업화에 이용하고자 한다.
제안 방법
E.coli에서 binary vector(pCAMBIA1302)를 증식한 후 Glut-1 유전자를 binary vector에 restriction enzymes, Bgl Ⅱ와 BstE Ⅱ를 이용하여 cloning 하였다. Glut-1유전자가 들어가 있는 Binary vector를 E.
Glut-1 유전자가 도입된 Chlamydomonas hedleyi 형질전환체의 NH4Cl 농도에 따른 세포성장 양상 및 biomass를 알아보기 위해 암상태, 배양온도 23℃로, NH4Cl 농도를 0, 100, 200, 400, 500 (μM) 함량을 확립하여 30일 동안 배양하였으며, 그 결과는 Fig. 2에 나타내었다.
Glut-1 유전자가 도입된 Chlamydomonas hedleyi 형질전환체의 glucose 15g/L, 400 μM NH4Cl 농도, 암상태, 배양온도 23℃를 확립하고, RF 처리에 따른 생장곡선 및 biomass를 확인하였다.
Glut-1 유전자가 도입된 Chlamydomonas hedleyi 형질전환체의 glucose 농도에 따른 세포성장 양상 및 biomass를 알아보기 위해 암상태, 배양온도 23℃로, Glucose 5, 10, 15, 20, 25 (g/L) 함량을 확립하여 30일 동안 배양하였으며, 그 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 세포성장 확인은 UV/Vis 분광기로 1일 간격으로 12 일간 O.
Glut-1 유전자가 형질전환 된 C.hedleyi 10 mg을 45℃ water bath에서 1ml의 20% 메탄올을 넣고 2 시간동안 반응시킨 후, 원심분리하여 상층액만을 취하여 동결건조한 뒤, 다시 100% 메탄올로 녹인 뒤 HPLC system (Waters 600)으로 330 nm에서 분석하였다. 표준품을 HPLC로 분석한 뒤 정량곡선을 그리고, 피크면적에 따른 넓이로 값을 환산하여 MAAs 양을 환산하였다.
02 A로 조절하여 노출되도록 하였다. RF는 15 분 노출, 45 분 휴식을 번갈아가며 6 회/1 일 간격으로 3 일간 처리하였다.
흡광도와 세포의 건조 질량과는 직선적인 비례관계가 성립하였으며 건조 균체량(Dry Cell Weight, DCW)의 상관관계식을 이용하여 계산하였다. 건조 균체량은 미리 건조기에서 건조하여 여과종이를 이용해 여과된 균체를 105℃로 조절된 건조기에서 3 시간동안 건조시킨 후 얻어진 건조무게로부터 건조 균체량을 계산하여 O.D.값과의 상관관계식을 산출하였다.
균체량은 UV/Vis 분광기 (Multiskan GO Microplate Spectrophotometer, Thermo Scientific Ltd, USA)를 이용하여 520 nm에서 측정한 흡광도 (Optical density, O.D.)를 통하여 간접적으로 관찰하였다. 흡광도와 세포의 건조 질량과는 직선적인 비례관계가 성립하였으며 건조 균체량(Dry Cell Weight, DCW)의 상관관계식을 이용하여 계산하였다.
Cl 농도, 암상태, 배양온도 23℃를 확립하고, RF 처리에 따른 생장곡선 및 biomass를 확인하였다. 배양 10일째 RF를 처리하여 생장곡선 및 biomass함량을 측정하였고, 그 결과는 Figure 3에 나타내었다. RF를 처리하였을 경우의 DCW는 1.
본 연구에서는 미세조류 Chlamydomonas hedleyi 에 Glucose transporter 유전자인 Glut-1을 도입한 형질전환 체를 활용하여 최적의 Glucose 농도, NH4Cl 농도를 확립한 후, RF 발생 장치가 결합된 생물반응기내에서 배양하며 고주파 처리를 통한 자외선 A흡수물질로 알려진 MAA 생산량을 증가를 확인하였다. Glucose 함량이 15g/L일 때 가장 좋은 세포의 성장과 가장 높은 DCW 3.
1에 나타내었다. 세포성장 확인은 UV/Vis 분광기로 1일 간격으로 12 일간 O.D. 값을 측정하였다. Glucose 함량이 15 g/L일 때 가장 좋은 세포의 성장을 확인할 수 있었고 가장 높은 DCW 3.
1에 나타내었다. 세포성장 확인은 UV/Vis 분광기로 1일 간격으로 12 일간 O.D. 값을 측정하였다. Glucose 함량이 15 g/L일 때 가장 좋은 세포의 성장을 확인할 수 있었고 가장 높은 DCW 3.
주입되는 기체는 0.2 μm의 필터를 통과시켜 기체에 포함된 오염균을 배제시켰다.
hedleyi 10 mg을 45℃ water bath에서 1ml의 20% 메탄올을 넣고 2 시간동안 반응시킨 후, 원심분리하여 상층액만을 취하여 동결건조한 뒤, 다시 100% 메탄올로 녹인 뒤 HPLC system (Waters 600)으로 330 nm에서 분석하였다. 표준품을 HPLC로 분석한 뒤 정량곡선을 그리고, 피크면적에 따른 넓이로 값을 환산하여 MAAs 양을 환산하였다.
)를 통하여 간접적으로 관찰하였다. 흡광도와 세포의 건조 질량과는 직선적인 비례관계가 성립하였으며 건조 균체량(Dry Cell Weight, DCW)의 상관관계식을 이용하여 계산하였다. 건조 균체량은 미리 건조기에서 건조하여 여과종이를 이용해 여과된 균체를 105℃로 조절된 건조기에서 3 시간동안 건조시킨 후 얻어진 건조무게로부터 건조 균체량을 계산하여 O.
대상 데이터
9.4±1.9 μm의 크기를 가진 구형의 형태로 인천대학교 자연과학대학 해양학과로부터 분양받아 사용하였다.
Glut-1 유전자가 도입된 형질전환체 균주는 Pyrex glass (650 mm height, 35 mm internal diameter)로 제작된 5L jar fermenter (주)씨엔에스, Model명; Marado-PDA)에서 배양되었다. 배양 조건은 필터 된 멸균된 공기가 공급되면서 23℃에서, pH 7.
본 연구에서 사용된 미세조류는 해양 서식 녹조식물문 녹조강 볼복스목 볼복스과인 Chlamydomonas hedleyi이다. 9.
성능/효과
13 g/L을 확인하였다. 10 g/L, 5 g/L의 glucose 함량에서도 세포성장은 확인할 수 있었고, DCW 각각 2.26 g/L, 1.4 g/L를 확인하였다. 반면, 20 g/L 및 25 g/L glucose 함량에서는 세포성장도 미비하였고, 0.
값을 측정하였다. Glucose 함량이 15 g/L일 때 가장 좋은 세포의 성장을 확인할 수 있었고 가장 높은 DCW 3.13 g/L을 확인하였다. 10 g/L, 5 g/L의 glucose 함량에서도 세포성장은 확인할 수 있었고, DCW 각각 2.
Glucose 함량이 15g/L일 때 가장 좋은 세포의 성장과 가장 높은 DCW 3.13 g/L을 확인하였고, 400μM NH4Cl 농도에서 가장 높은 MAAs 3.23mg/g· DCW 함량을 확인하였다.
NH4Cl 농도에 따라 세포성장이 달라짐을 확인하였고, 0, 100, 200μM NH4Cl 처리에 의해서 각각 MAAs 1.89, 2.24, 2.86 mg/g· DCW 증가됨을 확인하였고, 400μM NH4Cl 농도에서 가장 높은 MAAs 3.23 mg/g· DCW 함량을 확인하였다.
RF를 처리하였을 경우의 DCW는 1.90g/L, RF를 처리하지 않았을 경우의 DCW 2.26g/L보여 RF를 처리하였을 경우, 세포성장이 줄어듬을 확인하였고, 각각의 MAA 함량 4.13, 3.23mg/g·DCW 확인하여 RF를 처리하였을 경우 MAA함량이 증가됨을 확인하였다.
따라서, Glut-1 유전자가 형질전환된 미세조류 Chlamydomonas hedleyi에서 310 ∼360nm 파장영역에서 강한 흡수를 보이는 MAAs를 증가시켜 분리정제하여 유기계 자외선 흡수제의 피부자극성 및 난용해성, 킬레이트 형성에 의한 착색, 광분해로 인한 역가 저하 등의 여러 가지 문제점과 대표적 무기계 자외선 산란제인 TiO2와 ZnO의 백탁 현상을 극복할 수 있는 자연친화적이며 친환경적인 피부 적합도가 높아 자극이 없는 자외선 차단 화장품 산업화에 크게 기여할 수 있음을 의미한다.
또한, RF를 처리하였을 경우 MAA 함량 4.13 mg/g·DCW 확인하여 DCW함량은 줄어들더라도 MAA함량은 증가됨을 확인하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
자외선은 생물체에게 어떤 영향을 미치는가?
자외선은 직접적으로 DNA와 단백질의 변형을 유도하고, 간접적으로 활성산소를 생산하여 세포손상을 유도 하는 태양광선이다[1,2]. 자외선은 생리적 및 생화학적 과정에 영향을 미쳐 생물의 생존, 성장, 색소화, 광합성, 질소대사, 색소단백질 조성 및 이산화탄소 흡수 등에 영향을 미친다[3-5]. 많은 광합성 생물은 가시광선 및 자외선에 자동적으로 노출되므로 자외선의 손상효과를 극복할수 있는 기작을 진화시켜왔다[6].
자외선이란 무엇인가?
자외선은 직접적으로 DNA와 단백질의 변형을 유도하고, 간접적으로 활성산소를 생산하여 세포손상을 유도 하는 태양광선이다[1,2]. 자외선은 생리적 및 생화학적 과정에 영향을 미쳐 생물의 생존, 성장, 색소화, 광합성, 질소대사, 색소단백질 조성 및 이산화탄소 흡수 등에 영향을 미친다[3-5].
광합성 생물들이 진화시켜온 자외선의 손상효과를 극복할 수 있는 기작에는 무엇이 있는가?
많은 광합성 생물은 가시광선 및 자외선에 자동적으로 노출되므로 자외선의 손상효과를 극복할수 있는 기작을 진화시켜왔다[6]. 이러한 기작에는 자외선에 의해 유도되는 DNA 손상의 회복, 카로티노이드 축적, 해독효소, 라디칼 소거 및 항산화제 및 자외선 흡수/ 차단 화합물의 합성 등을 포함한다[7,8].
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