[논문]전복 용매 추출물의 세포독성과 항산화 활성

임선영

doi:10.5352/jls.2014.24.7.737

전복 용매 추출물의 세포독성과 항산화 활성
Cytotoxic and Antioxidant Activities of Abalone (Haliotis discus hannai) Extracts 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.24 no.7 = no.171, 2014년, pp.737 - 742

초록
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본 연구에서는 전복을 동결 건조시킨 후 전복의 지방산을 비교 분석하였고 세포독성 활성 및 세포 내 활성산소종 생성 억제 효과를 측정하여 전복의 생리활성을 알아보고자 하였다. 지방산 조성 변화를 살펴보면 포화지방산들 내에서는 16:0의 함량이 건조 전복에서 높았고 불포화지방산들 내에서는 건조 전복의 경우 낮은 함량의 20:4n-6와 높은 함량의 22:6n-3를 나타내었다. 전복 A+M 추출물을 0.05 및 0.1 mg/ml 첨가농도로 HT-29 암세포에 처리했을 때 24%의 세포독성 효과를 나타내었다(p<0.05). MeOH 추출물의 경우 A+M 추출물과 비교했을 때 세포독성 효과가 낮았다. 건조 전복의 각 분획물을 농도별로 처리하였을 때, 농도의존적으로 세포독성 활성을 나타내었고, 특히 85% aq. MeOH 분획물에 의한 세포독성 활성이 가장 높았다(p<0.05). 세포 내 활성산소종 생성 억제효과에서 낮은 농도에서는 MeOH 추출물보다는 A+M 추출물에 의한 저해효과가 높았으며 분획물들 간 큰 차이는 없으나 85% aq. MeOH 분획물에 의한 생성 억제효과가 다소 높아 36%의 활성산소종 억제효과를 나타내었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The objective of this study was to investigate the fatty acid composition of raw and dried abalone (Haliotis discus hannai) and to determine the effect of abalone extracts on cytotoxic activity and anti-oxidant properties. Dried abalone was extracted with acetone/methylene chloride (A+M) and methanol (MeOH), and the extracts were fractionated using n-hexane, 85% aq. methanol (MeOH), butanol (BuOH), and water. Cytotoxic activity against HT-29 cancer cell lines was determined using the 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Antioxidant activity was measured using a fluorescence sensitive dye, 2'-7' dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA). The fatty acid composition of dried abalone was higher (22:6n-3) than that of raw abalone, and it had a lower percentage of 20:4n-6 than raw abalone. Analysis of cell viability showed that the crude extract treatments and fractions were cytotoxic, suppressing the growth of HT-29 cancer cell lines (p<0.05). The A+M extract showed a higher cytotoxic effect on the growth of HT-29 cells compared to the MeOH extract. Among the fractions, the 85% aq. MeOH fraction showed the strongest cytotoxicity against the growth of HT-29 cells. The highest activity in terms of scavenging reactive oxygen species (ROS) was likewise obtained with the use of 85% aq. MeOH. Our results suggest that the 85% aq. MeOH fraction has a potent inhibitory effect on the proliferation of human cancer cells.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

일반적으로 활성산소종은 superoxide를 비롯하여 hydrogen peroxide, hydroxyl radical, 알킬 과산화물 등을 포함하고 구조적으로 하나의 부대 전자를 가지므로 반응성이 매우 크고 불안정한 화합물을 말한다[2]. 따라서 본 연구에서는 전복 추출물 및 분획물을 인체 섬유육종세포(HT-1080)에 처리했을 때 세포 내 활성산소종 생성 저해 효과에 대해 살펴보았다. Fig.
오래 전부터 전복에 관한 연구가 이루어지고 있는데 대부분은 전복의 양식기술 및 사료개발[15, 18, 24]에 관한 것이 많고 식품으로서 전복에 관한 연구도 전복을 이용한 가공에 관한 연구로 음용 전복추출물의 최적 제조조건 및 품질특성[22], 전복과 다시마 추출물을 첨가한 김치의 발효 특성[17], 고추장 숙성 전복의 제조와 이화학적 특성에 관한 연구[11], 전복물김치의 발효특성 및 영양성분의 변화[6] 등이 있다. 하지만 전복의 기능성과 성분에 대한 연구는 거의 없는 실정이므로 본 연구에서는 예로부터 보양식으로 섭취되어 왔으나 최근 과잉생산되고 있는 전복의 소비를 촉진하기 위하여 동결건조기를 이용하여 전복을 건조하고 건조된 전복의 지방산을 분석하였고 세포독성 활성 및 세포 내 활성산소종 생성 억제 효과를 측정하여 전복의 생리활성을 알아보고자 한다.

제안 방법

이 과정을 2회 반복하여 얻은 여액은 40℃ 수욕상에서 rotary vacuum evaporator (N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하여 acetone/methylene chloride 추출물(A+M)을 얻었다. A+M 용매로 추출되지 않은 성분을 methanol (MeOH)로 추출하고 남은 잔사물에 A+M와 동량의 MeOH로 위와 동일한 방법으로 2회 반복한 후 농축하여 MeOH 분획물을 얻었다. 두 용매로부터 최대로 수득한 추출물을 혼합하여 다시 용매극성에 따라 순차적으로 분획하여 n-Hexane, 85% aqueous MeOH (85% aq.
한국세포주은행(Seoul, Korea)으로부터 인체 결장암세포(HT-29)와 인체 섬유육종세포(HT-1080)를 분양 받아 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. HT-29 및 HT-1080 세포는 100 unit/ml의 penicillin-streptomycin (GIBCO, Gaithersburg, MD, USA)과 10% FBS (Hyclone, Logan, UT, USA)가 함유된 RPMI 1640 (GIBCO)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator (MCO-15AC, SANYO Electric Biomedical Co., Tokyo, Japan)에서 배양하면서 배양 중인 세포를 일주일에 2번 새로운 배지로 바꿔주었다. 일주일 후 Phosphate Buffered Saline (PBS)으로 세척한 뒤 0.
MTT assay를 행하여 동결 건조시킨 전복 추출물 및 분획물의 HT-29 암세포에 대한 세포독성 효과를 살펴보았다. DMSO에 의한 독성은 값이 거의 변화하지 않았으므로 DMSO에 의한 독성은 세포의 생존율에 아무런 영향을 미치지 않았다.
대조군들(blank군과 control군)은 시료 대신 PBS를 처리하며, control군은 500 μM H2O2를 처리를 하고, blank군은 500 μM H2O2 대신 PBS를 처리하여 측정하였다.
A+M 용매로 추출되지 않은 성분을 methanol (MeOH)로 추출하고 남은 잔사물에 A+M와 동량의 MeOH로 위와 동일한 방법으로 2회 반복한 후 농축하여 MeOH 분획물을 얻었다. 두 용매로부터 최대로 수득한 추출물을 혼합하여 다시 용매극성에 따라 순차적으로 분획하여 n-Hexane, 85% aqueous MeOH (85% aq. MeOH), n-butanol (n-BuOH) 및 water 분획물을 얻었다. 실험에는 각각의 추출물들을 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 세포배지로 필요한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.
배양된 암세포는 96-well cell culture plate에 5×104 cells/ ml이 되도록 100 μl씩 분주하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 배지는 제거한 뒤 각 시료를 배지로 희석하여 각 well 당 100 μl씩 첨가하고, 대조군에는 시료대신 PBS를 100 μl씩 첨가하였다.
생전복과 동결 건조된 전복의 지방산 조성을 비교하여 건조 전후 전복의 영양성분 차이를 비교해 보았다. Table 1은 지방산 조성을 나타낸 것으로 총 포화지방산(saturated fatty acids, SFA)과 총 고도불포화지방산(polyunsaturated fatty acids, PUFA)의 함량에는 유의적 차이가 있었고 총 단일불포화지방산(monounsaturated fatty acids, MUFA)의 함량에는 생전복과 건조 전복에는 유의적 차이가 없었다.
시료에서 분리된 지방산을 1 μl 취하여 지방산 분석용 gas chromatography (CP-3380, Varian, Santa Clara, USA)에 주입 하여 지방산을 분석하였다[21].
, Tokyo, Japan)에서 배양하면서 배양 중인 세포를 일주일에 2번 새로운 배지로 바꿔주었다. 일주일 후 Phosphate Buffered Saline (PBS)으로 세척한 뒤 0.05% trypsin-0.02% EDTA(GIBCO)로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 cell culture flask에 10 ml씩 일정한 수로 분할하여 주입하고, 6-7일마다 계대배양 하면서 실험에 사용하였다.
기기의 분석조건은 injector 250℃, detector (FID) 250℃, oven (initial 130℃, 분당증가율은 175℃까지 4℃/min, 210℃까지 1℃/min, 245℃까지 30℃/min), carrier gas는 헬륨을 사용하였다. 지방산 분석은 표준용액의 retention time과 비교하여 정성하였고, 내부표준물질(22:3n-3, methyl ester)을 이용하여 총지방산을 정량하였으며 개개의 지방산들은 전체 peak area의 퍼센트로 산출하였다.
지질추출은 Folch 등[5]의 방법을 변형하여 실시하였으며 간단히 요약하면 다음과 같다. 전복은 5% butyl hydroxy toluene (BHT) 함유 methanol로 균질화하였다.

대상 데이터

10 μm film thickness) (Varian, Santa Clara, USA)이다. 기기의 분석조건은 injector 250℃, detector (FID) 250℃, oven (initial 130℃, 분당증가율은 175℃까지 4℃/min, 210℃까지 1℃/min, 245℃까지 30℃/min), carrier gas는 헬륨을 사용하였다. 지방산 분석은 표준용액의 retention time과 비교하여 정성하였고, 내부표준물질(22:3n-3, methyl ester)을 이용하여 총지방산을 정량하였으며 개개의 지방산들은 전체 peak area의 퍼센트로 산출하였다.
본 실험에 사용된 전복은 참전복(Haliotis discus hannai)으로 2013년 7-8월에 완도에서 생산된 것으로 길이는 평균 7 cm인 양식전복을 사용하였다. 전복은 내장을 제거하고 육질 깨끗이 세척한 후 동결건조기(Freeze drying DC400, Yamato Sci.
지방산 분석에 사용한 표준용액은 미국 NU-CHEK-PREP사(Elysian, USA)의 462 standard였으며, 이용된 column은 silica capillary column (CP-7856, 60 m ×0.32 mm inner diameter ×0.10 μm film thickness) (Varian, Santa Clara, USA)이다.
한국세포주은행(Seoul, Korea)으로부터 인체 결장암세포(HT-29)와 인체 섬유육종세포(HT-1080)를 분양 받아 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. HT-29 및 HT-1080 세포는 100 unit/ml의 penicillin-streptomycin (GIBCO, Gaithersburg, MD, USA)과 10% FBS (Hyclone, Logan, UT, USA)가 함유된 RPMI 1640 (GIBCO)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator (MCO-15AC, SANYO Electric Biomedical Co.

데이터처리

실험결과는 Mean ± SEM (Standard Error of Mean)으로 나타내었고 분석된 실험데이터는 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험자료로부터 ANOVA를 실시하여 95% 수준에서 유의성을 검증하였다.

이론/모형

이와 같은 방법을 한번 더 진행한 뒤 질소가스를 이용하여 지질층의 유기용매를 완전히 날린 다음 지질을 얻었다. Morrison과 Smith의 방법[19]에 따라 추출된 지질에 methylation용 시약인 14% boron trifluoride (BF₃) methanol 1 ml와 n-hexane 0.4 ml를 가한 후 1시간 동안 100℃에서 가열하였다. 1시간 후 실온까지 충분히 냉각시킨 다음 n-hexane 2 ml와 증류수 2 ml를 가한 후 다시 4℃, 195.
세포 내 활성산소종은 2',7’-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA) assay로 측정하였다[13].

성능/효과

4는 전복 분획물들에 의한 활성산소종 생성 억제효과를 나타낸 것으로 분획물들 간 큰 차이는 없으나 85% aq. MeOH 분획물에 의한 생성 억제효과가 다소 높아 36%의 활성산소종 억제 효과를 나타내었다. Kim 등[8]은 전복육질과 내장의 추출방법에 따른 추출물의 항산화 효과를 연구한 결과 아질산염 소거활성으로 평가한 항산화 효과는 90% 에탄올 추출물의 경우 전복 육질과 내장은 농도증가에 따라 직선적인 증가경향을 나타내었고 육질에 비해 내장에 의한 소거활성 효과가 높았다고 보고하였다.
생전복과 동결 건조된 전복의 지방산 조성을 비교하여 건조 전후 전복의 영양성분 차이를 비교해 보았다. Table 1은 지방산 조성을 나타낸 것으로 총 포화지방산(saturated fatty acids, SFA)과 총 고도불포화지방산(polyunsaturated fatty acids, PUFA)의 함량에는 유의적 차이가 있었고 총 단일불포화지방산(monounsaturated fatty acids, MUFA)의 함량에는 생전복과 건조 전복에는 유의적 차이가 없었다. SFA 내에서는 16:0의 함량이 건조 전복에서 높았고 PUFA 내에서는 건조 전복 경우 낮은 함량의 20:4n-6와 높은 함량의 22:6n-3를 나타내었다.
지방산 조성의 경우 국내산 전복은 20:0, 22:1n-9 및 22:6n-3 함량이 높았고 아미노산 조성의 경우 일본산 전복이 유용 아미노산을 많이 함유하고 있다고 보고하였다. 본 연구에서도 일본산 전복과 비교했을 때 이상의 지방산들의 함량이 높았다. Li 등[16]은 한국에서 생산되는 전복의 영양성분을 비교한 결과 지역간의 전복의 일반성분과 미네랄 함량은 다소 차이가 있는 것으로 나타났으며 수온이 낮은 지역일수록 지방함량이 약간 높았다고 보고하였다.

후속연구

따라서 본 연구 결과로부터 전복의 항산화 및 세포독성 효과는 85% aq. MeOH 분획물들 속에 있는 활성 성분과 관련이 있는 것으로 사료되며 향후 정제하여 규명할 필요가 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	전복은 무엇인가?	전복(Haliotis discus hannai)은 복조류에 속하는 수산생물로 비타민 B1 및 B2가 많고 칼슘, 인 등의 미네랄과 타우린이 풍부한 해산물로 우리나라에서는 전통적으로 강장과 신장을 보호하며 눈을 맑게 하고 위를 열어주며 해수를 다스리고 피로회복, 자양강장 등의 효과가 잇는 것으로 알려져 있어 건강식으로 애용되고 있다[10]. 과거에는 전복이 고급 어패류로 인식되어 전복 가격이 비싼 편이라 보편화되지 못한 실정이었다.
	전복의 항산화 및 세포독성 효과는 어떤 성분과 관련이 있는가?	따라서 여러 연구들을 참고했을 때 전복의 항산화 및 항암효과는 전복의 주요 먹이인 해조류에서의 결과와 유사함으로 해조류 중 갈조류의 탄닌 계 및 지용성 항산화 물질과 홍조류의 페놀성 화합물 및 인돌계 항산화성 물질들이 상호복합적인 기능적 효과를 나타내는 것으로 설명될 수 있다[3, 7, 9, 20]. 따라서 본 연구 결과로부터 전복의 항산화 및 세포독성 효과는 85% aq. MeOH 분획물들속에 있는 활성 성분과 관련이 있는 것으로 사료되며 향후 정제하여 규명할 필요가 있다.
	건조전후 전복의 영양성분 차이 중 지방산의 조성은 어떻게 나타나는가?	생전복과 동결 건조된 전복의 지방산 조성을 비교하여 건조전후 전복의 영양성분 차이를 비교해 보았다. Table 1은 지방산 조성을 나타낸 것으로 총 포화지방산(saturated fatty acids, SFA)과 총 고도불포화지방산(polyunsaturated fatty acids, PUFA)의 함량에는 유의적 차이가 있었고 총 단일불포화지방산(monounsaturated fatty acids, MUFA)의 함량에는 생전복과 건조 전복에는 유의적 차이가 없었다. SFA 내에서는 16:0의 함량이 건조 전복에서 높았고 PUFA 내에서는 건조 전복 경우 낮은 함량의 20:4n-6와 높은 함량의 22:6n-3를 나타내었다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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