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문제 정의
- Ethosome이 친수성, 소수성 물질 모두 포집이 가능하고 L-ascorbic acid, α-tocopherol이 같이 존재할 때 항산화 효능 및 안정성 향상 효과를 기대할 수 있는 점에 착안하여, 베시클에 두 물질 모두를 포집시키고 이에 따른 산화 안정성 향상 여부를 살펴보았다.
제안 방법
- 본 연구에서는 친수성 L-ascorbic acid와 소수성 α-tocopherol, 두 유효 물질 모두를 포집하는 ethosome 제조를 시도하였다.
- 이들 베시클은 공통적으로 기존의 일반 리포좀에 비해 극단적 변형(ultradeformation)이 가능하여 표피의 각질세포 간 지질층 사이로 침투이동이 더욱 효과적으로 이루어지지만 유효 성분의 포집효율이 그리 만족스럽지 못하거나 ethosome의 경우에는 물리적 안정성이 낮고 또한 피부 자극이 높은 에탄올 성분을 비교적 많이 함유하는 문제가 지적되어 왔다. 이에 따라 본 연구진은 기존 ethosome 제조 방식과 약간 다르게 2단계 과정(수화과정과 분산과정)으로 수화 액정형 베시클을 만들어 에탄올의 함량을 최소화하면서 ethosome의 포집효율을 더욱 높이는 체계적 고찰을 시도하였다[9,10].
- Ethosome이 친수성, 소수성 물질 모두 포집이 가능하고 L-ascorbic acid, α-tocopherol이 같이 존재할 때 항산화 효능 및 안정성 향상 효과를 기대할 수 있는 점에 착안하여, 베시클에 두 물질 모두를 포집시키고 이에 따른 산화 안정성 향상 여부를 살펴보았다. 또한 포집되는 두 물질의 농도에 따른 액정 배열 및 베시클 입자 형성의 변화, ethosome 특성 등을 살펴보면서 농도에 따른 영향을 분석하였다.
- 시료의 항산화 효능은 DPPH radical scavenging activity를 측정하여 살펴보았다. 0.
- 시료의 항산화 효능은 DPPH radical scavenging activity를 측정하여 살펴보았다. 0.2 mM DPPH 용액 1 mL에 각각의 시료 용액를 2 mL씩 첨가하여 충분히 섞은 후 실온에서 10 min 동안 반응시킨 후 UV-vis spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하여 다음 식에 따라 DPPH radical scavenging activity를 구하였다. 시료의 환원력 크기는 DPPH 라디칼 소거능(radical scavenging activity)과 SC50으로 표시하였다.
- AA와 TO가 ethosome에 포집되었을 때 항산화 효능이 안정화되는 효과를 확인하기 위해 시료별로 보관 시간에 따른 DPPH 라디칼 소거능의 변화를 관측하였다. 시료는 AA 수용액, AA만을 포집한 ethosome 현탁액, AA와 TO를 2 : 1의 비율로 포집한 ethosome 현탁액 등 세 종류로, 각각을 500 ppm 농도로 만들어서 40 ℃ 오븐과 UVA + B 램프가 장착된 오븐에 각각 보관하였다.
- AA와 TO가 ethosome에 포집되었을 때 항산화 효능이 안정화되는 효과를 확인하기 위해 시료별로 보관 시간에 따른 DPPH 라디칼 소거능의 변화를 관측하였다. 시료는 AA 수용액, AA만을 포집한 ethosome 현탁액, AA와 TO를 2 : 1의 비율로 포집한 ethosome 현탁액 등 세 종류로, 각각을 500 ppm 농도로 만들어서 40 ℃ 오븐과 UVA + B 램프가 장착된 오븐에 각각 보관하였다. 매주 일정량을 채취한 후 에탄올에 100 ppm농도로 희석하여 DPPH 소거능을 측정하였다.
- 시료는 AA 수용액, AA만을 포집한 ethosome 현탁액, AA와 TO를 2 : 1의 비율로 포집한 ethosome 현탁액 등 세 종류로, 각각을 500 ppm 농도로 만들어서 40 ℃ 오븐과 UVA + B 램프가 장착된 오븐에 각각 보관하였다. 매주 일정량을 채취한 후 에탄올에 100 ppm농도로 희석하여 DPPH 소거능을 측정하였다.
- 본 연구에서 ethosome 제조는 HPC를 소량의 에탄올에 용해시킨 후 여기에 적당량의 수용액을 첨가하여 수화에 의한 라멜라 액정상(이하 수화 액정)을 먼저 만들고, 이후에 교반과정을 통해 전단력을 가하면서 동시에 과량의 물을 조금씩 계속적으로 첨가해 나가는 방식으로 만들게 된다. 이러한 제조 과정 중에 연속상은 유상(oil phase)에서 수상(water phase)으로의 상 전환(phase inversion)이 일어나는 등 구성 성분 간 혼합 비율에 따라 여러 상(phase)의 변화가 일어나게 된다.
- 일반적으로 AA와 TO의 항산화 효능은 널리 알려져 있지만 본 연구에서 사용된 AA와 TO의 항산화 효능 비교를 위해 각각의 농도별 DPPH radical 소거능을 살펴보았다(Figure 8). 그림으로부터 두 물질의 SC50 값을 유추해보니 대략 AA는 5.
- 7 ppm으로, AA가 TO보다 DPPH radical 소거능이 좀 더 우수한 결과가 나타났다. AA를 TO과 함께 ethosome에 포집시켰을 때 두 물질이 안정화되는지여부를 살펴보았다. DPPH assay을 이용하여 1주 간격으로 시간 경과에 따른 라디컬 소거능 변화를 살펴보았는데, 40 ℃ 고온에 있을 때(a)와 UV 빛이 조사되었을 때(b) 각각의 결과를 Figure 9에 나타내었다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용한 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical, L-ascorbic acid (이후 AA로 표기), α-Tocopherol (TO)은 모두 Sigma Chemical 회사의 제품을 사용하였다.
- Ethosome의 주성분인 인지질은 soybean에서 추출한 지질을 수소 첨가시켜 불포화 성분을 없앤 레시틴 (Lecithin)으로 Phosphatidyl choline (PC) 성분이 95% 이상인 Emulmetik 950 (Lucas Meyer)을 사용하였으며 편의상 명칭을 HPC (Hydrogenated phosphatidyl choline)로 나타내었다. 레시틴 용해에 사용되는 에탄올은 EP급을 사용하였다. HPLC 이동상 제조 시 쓰이는 phosphoric acid는 Sigma 제품을, 정제수는 HPLC 등급용으로 각각 사용하였다.
- 레시틴 용해에 사용되는 에탄올은 EP급을 사용하였다. HPLC 이동상 제조 시 쓰이는 phosphoric acid는 Sigma 제품을, 정제수는 HPLC 등급용으로 각각 사용하였다.
- 제조된 ethosome의 AA의 포집효율을 측정하기 위해서 stirred ultrafiltration cell (SUC)과 15 nm pore size의 membrane을 사용하였다. 먼저 ethosome 현탁액을 SUC에 넣고 stirrer를 24 h 회전시키면서 현탁액 중 ethosome 베시클을 걸러내고 여과액을 모은다.
- DPPH assay을 이용하여 1주 간격으로 시간 경과에 따른 라디컬 소거능 변화를 살펴보았는데, 40 ℃ 고온에 있을 때(a)와 UV 빛이 조사되었을 때(b) 각각의 결과를 Figure 9에 나타내었다. 비교 대상 시료는 AA 수용액, AA만을 포집한 ethosome 현탁액, AA 와 TO 모두를 포집한 ethosome 현탁액 등 3가지이다. 40 ℃의 오븐에보관했을 때 AA 수용액은 첫 주부터 산화가 일어나기 시작하여 4주에는 라디칼 소거능이 완전히 소멸되었다.
- 친수성 AA와 소수성 TO를 모두 포집하는 ethosome 베시클을 제조하였다. AA를 포집한 ethosome을 만들기 위해 에탄올에 용해된 HPC에 AA 수용액을 첨가하는데 이때 첨가되는 AA 수용액의 농도가 높을수록 ethosome 입자크기가 작아진다.
이론/모형
- Ethosome의 입자 크기는 레이저 광 산란 측정 장치인 PSS의 Nicomp 380 모델을 사용하여 측정하였고 액정의 열적특성을 분석하기 위하여 TA사의 DSC (model Q10)를 사용하였다. 전도도 변화는 conductivity meter (Orion model 150)를 사용하였고 DPPH 실험에서 사용되는 UV-vis spectrophotometer는 MECASYS사의 Optizen 모델을 사용하였다.
- Ethosome의 입자 크기는 레이저 광 산란 측정 장치인 PSS의 Nicomp 380 모델을 사용하여 측정하였고 액정의 열적특성을 분석하기 위하여 TA사의 DSC (model Q10)를 사용하였다. 전도도 변화는 conductivity meter (Orion model 150)를 사용하였고 DPPH 실험에서 사용되는 UV-vis spectrophotometer는 MECASYS사의 Optizen 모델을 사용하였다. 표면장력은 Wilhelmy plate 타입의 표면장력계로 KSV사의 sigma 703 모델을 사용하였다.
- 전도도 변화는 conductivity meter (Orion model 150)를 사용하였고 DPPH 실험에서 사용되는 UV-vis spectrophotometer는 MECASYS사의 Optizen 모델을 사용하였다. 표면장력은 Wilhelmy plate 타입의 표면장력계로 KSV사의 sigma 703 모델을 사용하였다. AA의 정량분석을 위해 사용한 HPLC는 Young-Lin Acme 모델을 사용하였다.
- 표면장력은 Wilhelmy plate 타입의 표면장력계로 KSV사의 sigma 703 모델을 사용하였다. AA의 정량분석을 위해 사용한 HPLC는 Young-Lin Acme 모델을 사용하였다. 초음파 기기는 Sonics & Materials Inc.
- 초음파 기기는 Sonics & Materials Inc.의 VC505 모델(probe type)을 사용하였다.
성능/효과
- HPC 단독으로 만들어진 ethosome은 입자크기가 90 nm이지만 HPC에 TO를 혼합하면 20 wt% 혼합비율까지는 TO 양에 비례하여 ethosome 입자 크기가 서서히 증가하다 25 wt% 이상의 혼합비율에서는 입자 크기가 360 nm 로 크게 증가하는 결과가 나타났다.
- 일반적으로 AA와 TO의 항산화 효능은 널리 알려져 있지만 본 연구에서 사용된 AA와 TO의 항산화 효능 비교를 위해 각각의 농도별 DPPH radical 소거능을 살펴보았다(Figure 8). 그림으로부터 두 물질의 SC50 값을 유추해보니 대략 AA는 5.0 ppm, TO는 9.7 ppm으로, AA가 TO보다 DPPH radical 소거능이 좀 더 우수한 결과가 나타났다. AA를 TO과 함께 ethosome에 포집시켰을 때 두 물질이 안정화되는지여부를 살펴보았다.
- 이에 반해 AA만이 ethosome 에 포집된 현탁액의 경우 3주까지도 라디칼 소거능이 70% 이상 유지 되는 등 베시클 포집에 의해 AA의 산화가 지연되었다. 더 나아가 AA 와 TO가 ethosome에 공동으로 포집된 현탁액의 경우는 관찰된 5주 동안에 라디칼 소거능이 그대로 일정하게 유지되었다. 이는 TO가 베시클 막 성분으로 존재하면서 AA 항산화 효능의 안정화에 기여한 결과로 이미 여러 논문에서 AA와 TO 혼합에 의한 항산화의 시너지 효과를 발표한 바 있다[18,19].
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