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문제 정의
- 8) 그러나 아직 골육종에서 CTGF의 기능과 역할에 대한 연구는 거의 없는 실정이다. 본 연구에서는 CTGF의 골육종에서 발현 정도와 발암기전에서의 역할에 대한 연구를 시행하였다.
제안 방법
- 1×105개의 세포 300 μl를 각 chamber에 심고 24 시간 동안 matrigel에 침윤되도록 하였다.
- ABI prism 7000 SDS software version 1.0을 이용하여 PCR을 시행하였고 CTGF 유전자의 증폭을 위해 50oC 2분, 95oC에서 10분간의 변성 후 95oC 15초, 60oC 1분의 45 cycles 조건으로 PCR을 시행 하였다. Total 25 μl의 혼합물에는 5 μl의 cDNA, 2Ｘ Taqman probe mixture 12.
- CTGF의 cell invasion에서의 역할을 관찰하기 위해 Matrigle invasion assay를 시행하였다 siRNA를 transfection한 세포에서 유의하게 invasion이 억제되는 것을 관찰하였다(Fig. 3).
- CTGF의 cell proliferation에서의 역할을 관찰하기 위해 WST-1 assay를 시행하였다 siRNA를 transfection한 세포에서 cell proliferation이 억제되는 것을 관찰하였고 통계적으로 유의하였다(p<0.05) (Fig. 4).
- 막 위쪽에 있는 침윤되지 못한 세포는 닦아서 제거하며, 막 아래 쪽에 침윤된 세포는 Quick-Diff stain kit (Becton-Dickinson)로 염색하였다. Chamber 들을 dH2O로 두 번 씻은 후 공기 중에 말린 후 세포의 수를 위상차 현미경하에서 계산하였다.
- 1% Tween-20)로 1시간 blocking한 후 1'ab antibody/5% skin milkTBS-T로 4oC에서 O/N 동안 incubation 한다. TBS-T로 washing하여 secondary antibody로 1시간 더 incubation 하고 다시 TBS-T로 washing한 후 ECL Western blot detection system을 이용하여 단백질을 탐색하였다. 분자량은 미리 착색시킨 molecular weight standard와 비교하였다.
- 동일한 23명의 항암 치료 전 환자 조직으로부터 분리 배양한 골육종 세포주에서 reverse transcription PCR로 CTGF의 발현 정도를 관찰하였다. 17명(74%)의 세포주에서 control 세포인 정상 골모세포(normal osteoblast, hFOb 1.
- CTGF의 단백질 수준에서의 발현을 Western blot analysis를 통해 발현을 살펴보았다. 배양된 세포를 lysis한 후 Bio-Rad protein assay를 이용하여 단백질을 정량하였다. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel상에서 전기영동 하여 단백질을 분리한 후 nitrocellulose membrane에 transfer하였다.
- TBS-T로 washing하여 secondary antibody로 1시간 더 incubation 하고 다시 TBS-T로 washing한 후 ECL Western blot detection system을 이용하여 단백질을 탐색하였다. 분자량은 미리 착색시킨 molecular weight standard와 비교하였다.
- 세포 침윤 분석은 BIOCOAT matrigel invasion chamber (BectonDickinson, Bedford, MA, USA)를 사용하여 사용설명서에 따라 분석하였다. 1×105개의 세포 300 μl를 각 chamber에 심고 24 시간 동안 matrigel에 침윤되도록 하였다.
대상 데이터
- Cell에 Transfection한 CTGF siRNA의 sequence는 5'-GAA AAG AUU CCC ACC CAA U(dTdT)-3'을 사용하였다.
- Control RNA(scramble RNA)로는 5'-GUG UCA ACC AUG AGA AGU A(dTdT)-3'가 사용하였다.
- (A, B) Western blot analysis and (C, D) Real-time PCR. MG63 (A,C) and SaOS-2 (B, D) cell lines were used. *p<0.
- (A, B) Western blot analysis and (C, D) Real-time PCR. MG63 (A,C) and SaOS-2 (B, D) cell lines were used. *p<0.
- SaOS-2와 MG63세포주를 10% FBS가 포함된 배지로 100 mm dish (2×106 cells)에 plating하였다.
- 53 mM EDTA4Na로 분리하여 subculture하였다. 골육종 세포주로는 SaOS-2와 MG63를 사용하였다. 정상 세포주로는 골모세포 세포주(hFOb 1.
- 골육종 세포주로는 SaOS-2와 MG63를 사용하였다. 정상 세포주로는 골모세포 세포주(hFOb 1.19)을 이용하였다.
데이터처리
- , Chicago, Illinois, USA, 한글판 version 12)를 사용하였다. 다른 군간의 평균 비교는 독립 t-test 검정법을 사용 하였고, p value가 0.05보다 작을 때 통계학적으로 유의 하다고 판정하였다.
이론/모형
- CTGF의 단백질 수준에서의 발현을 Western blot analysis를 통해 발현을 살펴보았다. 배양된 세포를 lysis한 후 Bio-Rad protein assay를 이용하여 단백질을 정량하였다.
- GAPDH은 internal standard로 사용하여. 정량분석은 standard curve method를 이용하였다. 이 값은 정상 세포주 gene 의 normalized expression에 상대적인 미확인 샘플의 target gene의 normalized expression을 의미하게 된다.
성능/효과
- 10) 식도암에서는 CTGF의 과발현이 대다수의 예에서 관찰되었고 특히, 예후가 안 좋았던 경우에 발현이 높았다.11) 횡문근육종의 경우에도 높은 발현을 보였으며 암세포의 생존과 밀접한 관련을 보였다.12) 본 연구에서는 CTGF의 발현을 real-time PCR로 확인하였는데 보다 많은 수의 환자에서 면역조직화학염색을 시행하는 것이 필요할 것으로 생각된다.
- CTGF는 CCN family의 6가지 중 하나로 세포 부착(adhesion), 세포 이동, 세포 생존, 분화, 혈관 생성 등 다양한 생리적인 pathway에 관여하는 것으로 알려져 있다.3) 발암 과정은 암 주변 세포외기질의 변화와 밀접한 관련을 가지고 있고 다양한 암종에서 CTGF의 발현이 증가되어 있다.13) 특히 혈관 생성과 세포 생존에 있어서 CTGF는 밀접한 관련을 보이는 것으로 알려져 있다.
- 3) 최근 들어 정상 조직에 비해 여러 암 조직에서 CTGF의 발현이 증가되어 있음이 밝혀지면서 CTGF가 암의 진행 과정에 관여할 것이라는 추측을 하게 되었다. Pan 등은 교아세포종(glioblastoma)에서 CTGF가 종양의 진행에 있어 혈관생성인자로서의 역할을 할 가능성이 있음을 보고하였고4) Dhar 등은 유방암에서 CTGF의 과발현이 55%로 관찰된다고 보고하였으며,5) Lin 등은 위암 세포의 조직침습에서 CTGF의 종양 촉진 기능을 보고하였다.
- 9) Glioblastoma에서는 58%에서 CTGF의 과발현이 관찰되었고 조직학적 악성도와 CTGF의 발현과의 상관성이 높았다.10) 식도암에서는 CTGF의 과발현이 대다수의 예에서 관찰되었고 특히, 예후가 안 좋았던 경우에 발현이 높았다.
- CTGF의 발암기전에서의 역할을 관찰하기 위해 불멸화된 골육종 세포주 SaOS-2와 MG63에서 siRNA로 CTGF의 발현을 억제하였다. Western blot 분석 결과 siRNA를 transfection한 세포에서 유의 하게 발현이 억제되는 것을 관찰하였고 통계적으로 유의하였다 (p<0.
- 골육종 세포주에서 CTGF의 발현이 높았고 세포침습, 세포 성장에 관여하는 바 CTGF가 골육종의 발암기전에서 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다. 항암 치료 타깃으로서의 후보 물질로 추후 연구가 필요한 것으로 생각된다.
- 이런 현실에서 다른 여러 종류의 고형 암에서 종양의 침습이나 원격 전이 능력 등과 연관성이 밝혀지고 있는 CTGF에 대한 연구는 의미가 있는 것으로 생각된다. 본 연구의 결과에 따르면 골육종에서 CTGF의 발현이 정상 조직에 비해 증가되어 있었고 CTGF가 골육종 세포의 전이와 관련이 있는 세포 침습과 세포 증식을 증가시켰다. 이 결과는 CTGF가 골육종의 치료 타깃으로서 가능성을 나타내는 것으로 판단된다.
- 본 연구의 결과에 따르면 골육종에서 CTGF의 발현이 정상 조직에 비해 증가되어 있었고 CTGF가 골육종 세포의 전이와 관련이 있는 세포 침습과 세포 증식을 증가시켰다. 이 결과는 CTGF가 골육종의 치료 타깃으로서 가능성을 나타내는 것으로 판단된다.
후속연구
- 12) 본 연구에서는 CTGF의 발현을 real-time PCR로 확인하였는데 보다 많은 수의 환자에서 면역조직화학염색을 시행하는 것이 필요할 것으로 생각된다.
- CTGF의 발현에 대한 조절 기전은 정확히 밝혀지지 않았으나 전사 단계(transcriptional level)에서 이루어 지는 것으로 생각되고 있는데, 이로 인해 CTGF단백의 발현은 CTGF mRNA의 발현 양상을 가깝게 따르는 경향이 있다고 보고되었다.3) 향후 CTGF의 발현 정도와 골육종 환자들의 임상적 예후와의 연관성을 분석하는 것은 CTGF의 임상적 유용성을 수립하는데 도움을 줄 수 있는 방법이 될 수 있으리라 생각한다.
- CTGF의 골육종에서 발암기전에서의 역할은 본 연구의 결과를 바탕으로 in vivo 동물실험을 통하여 보다 확립할 수 있을 것으로 판단된다. In vivo 실험을 통하여 CTGF가 전이에 관여하는지 여부를 확인할 필요가 있을 것으로 생각된다.
- CTGF의 골육종에서 발암기전에서의 역할은 본 연구의 결과를 바탕으로 in vivo 동물실험을 통하여 보다 확립할 수 있을 것으로 판단된다. In vivo 실험을 통하여 CTGF가 전이에 관여하는지 여부를 확인할 필요가 있을 것으로 생각된다. 또한, CTGF의 발현을 mRNA 수준에서 관찰한 바 단백질 수준에서도 관찰할 필요가 있을 것으로 판단된다.
- In vivo 실험을 통하여 CTGF가 전이에 관여하는지 여부를 확인할 필요가 있을 것으로 생각된다. 또한, CTGF의 발현을 mRNA 수준에서 관찰한 바 단백질 수준에서도 관찰할 필요가 있을 것으로 판단된다. CTGF의 발현에 대한 조절 기전은 정확히 밝혀지지 않았으나 전사 단계(transcriptional level)에서 이루어 지는 것으로 생각되고 있는데, 이로 인해 CTGF단백의 발현은 CTGF mRNA의 발현 양상을 가깝게 따르는 경향이 있다고 보고되었다.
- 골육종 세포주에서 CTGF의 발현이 높았고 세포침습, 세포 성장에 관여하는 바 CTGF가 골육종의 발암기전에서 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다. 항암 치료 타깃으로서의 후보 물질로 추후 연구가 필요한 것으로 생각된다.
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