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문제 정의
- 15) 다품종 소량생산이 대부분 국내 제약업계의 제조형태임을 감안하면 다수의 제조번호에 대해 신속하게 품질적부 판정을 할 수 있는 신속하고 간단하면서 편차가 적은 품질시험법의 도입은 무엇보다 중요하다.16-18) 이에 본 연구에서는「대한민국약전외의약품기준」 수재 의약품 각조 중 시험법이 노후되어 시험법 개선이 시급하고 현재 생산유통이 활발하여 의약품시험검정 및 품질관리와 관련한 재검토가 우선적으로 필요한 품목으로 암브록솔염산염 및 클렌부테롤염산염 제제를 선정하여 시험법 개선을 위한 연구를 수행하였다. 식약처의 "의약품등 시험방법 밸리데이션 가이드라인"에 따라 분석법 밸리데이션을 통하여 전처리법 및 함량 분석 조건을 설정하고 유통 제품의 함량시험을 수행하여 최종 확립하고자 하였다.
- 식약처의 "의약품등 시험방법 밸리데이션 가이드라인"에 따라 분석법 밸리데이션을 통하여 전처리법 및 함량 분석 조건을 설정하고 유통 제품의 함량시험을 수행하여 최종 확립하고자 하였다.
제안 방법
- 21-24) 클렌부테롤염산염의 HPLC 분석조건은 Capcell Pak C18(5 μm, 150×4.6 mm) 칼럼을 사용하여 옥탄설폰산나트륨 6g에 인산이수소칼륨 5g을 넣어 인산으로 pH 3.0으로 맞춘액과 아세토니트릴, 메탄올의 혼합액을 600 : 200 : 200의 비율로 조제한 이동상으로 유량 1.0 ml/min로 하여 자외부흡광광도계의 측정파장을 215 nm로 하여 분석하였다.
- 고성능 액체크로마토그래프(HPLC) 이동상 제조에 사용한 아세토니트릴 및 메탄올 등의 시약은 Merck사(Darmstadt, Germany)의 HPLC 등급을 사용하였다. HPLC는 Waters사(Milford, MA, USA)의 Alliance 2695 Separations Module, 2998 Photodiode Array Detector로 분석하였다.
- HPLC의 분석조건 및 밸리데이션 결과를 바탕으로 설정된 전처리 방법(Fig. 3)으로 암브록솔염산염 시럽은 시험약 A, B, 클렌부테롤염산염 시럽은 시험약 C, 암브록솔염산염·클렌부테롤 염산염 복합시럽제는 시험약 D, E, 암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 복합정제는 시험약 F, G 에 대하여 함량시험을 실시하였다.
- 검액 및 표준액 10 μl씩을 가지고 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 암브록솔염산염의 피크면적을 구했다.
- 검액 및 표준액 20 μl씩을 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 클렌부테롤염산염의 피크면적을 구했다.
- 이는 실험법 개선을 통해 환경과 실험실내 유해한 요소를 경감하는 효과를 가져온 것으로 판단된다. 또한 추출법을 희석법으로 변경한 새로운 시험법은 시간과 비용이 개선되었고, 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 정량한계를 확인하고 국내유통 의약품 중에서 시험약을 선정하여 기존 시험법과 비교분석 후 확립된 시험법 및 규격을 적용해 보았다. 이는 신속하고 재현성 있는 시험법의 설정으로 의약품의 품질관리 수준을 향상시킬 수 있으며, 본 연구에서 제안하는 시험규격은 식품의약품안전처고시「대한민국약전외 의약품 기준」개정 시 기초자료로 활용 가능하며, 국내 유통의약품의 생산·유통과정에 있어서 일정한 품질이 확보된 제품을 지속적으로 공급하는데 기여할 것으로 기대된다.
- 암브록솔염산염 시럽·정 − 특이성은 표준액 및 희석용매를 검액으로 하여 이들의 크로마토그램 및 포토다이오드어레이(PDA)를 이용하여 첨가제에 의한 주성분 피크의 간섭여부를 확인하였다.
- 암브록솔염산염 시럽·정 − 함량 분석법의 밸리데이션 결과 포토다이오드어레이(PDA)를 이용하여 주성분 피크의 단일성 여부를 확인하였다(Fig. 4).
- 암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 복합정제 중 암브록솔염산염 − 검체 20정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 하였다.
- 암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 복합정제 중 클렌부테롤염산염 − 검체 20정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 하였다.
- 암브록솔염산염과 클렌부테롤염산염 성분 함유 제제의 함량시험 조건 개선을 위해 "의약품등 시험방법 밸리데이션 가이드라인"에 따라 각 제형(단일성분 및 복합성분 시럽제, 정제)에 적용할 시험법에대한 밸리데이션을 수행하였다.
- 암브록솔염산염의 HPLC 분석조건은 Capcell Pak C18(5 μm, 150×4.6 mm) 칼럼을 사용하여 탄산암모늄 1g을 물 1000 ml에 녹이고 이 액 430 ml에 아세토니트릴 570 ml를 넣어 조제한 이 동상으로 유량 1.0 ml/min로 하여 자외부흡광광도계의 측정파장을 244 nm로 하여 분석하였다.
- 0 μg/ml)을 가지고 분석법의 전 조작을 6회 반복 측정한 결과로부터 상대표준편차(%)를 계산하여 정밀성을 평가하였다. 정량한계는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법에 따라 구하였다.
- 0 μg/ml)을 가지고 분석법의 전 조작을 6회 반복 측정한 결과로부터 상대표준편차(%)를 계산하여 정밀성을 평가하였다. 정량한계는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법에 따라 구하였다.
- 정밀성은 암브록솔염산염 표준품(99.97%) 15 mg 을 정밀히 취하여 0.1 mol/l 메탄올성염산시액에 녹여 정확하게 100 ml로 한 것을 표준원액(150.0 μg/ml)으로 하고, 표준원액 5ml 를 취하여 0.1 mol/l 메탄올성염산시액을 가하여 50 ml로 한 정밀성시험용액(15.0 μg/ml)을 가지고 분석법의 전 조작을 6회 반복 측정한 결과로부터 상대표준편차(%)를 계산하여 정밀성을 평가하였다.
- 정밀성은 클렌부테롤염산염 표준품(100.0%) 10 mg을 정밀히 취하여 이동상에 녹여 정확하게 100 ml로 한 것을 표준원액 (100.0 μg/ml)으로 하고, 표준원액 1ml를 취하여 이동상을 가하여 200 ml로 한 정밀성시험용액(0.5 μg/ml)을 가지고 분석법의전 조작을 6회 반복 측정한 결과로부터 상대표준편차(%)를 계산하여 정밀성을 평가하였다.
- 정밀성은 클렌부테롤염산염 표준품(100.0%) 10 mg을 정밀히 취하여 이동상에 녹여 정확하게 100 ml로 한 것을 표준원액(100.0 μg/ml)으로 하고, 표준원액 1 ml를 취하여 이동상을 가하여 100 ml로 한 정밀성시험용액(1.0 μg/ml)을 가지고 분석법의 전 조작을 6회 반복 측정한 결과로부터 상대표준편차(%)를 계산하여 정밀성을 평가하였다.
- 0 μg/ml 해당액을 표준액 I, II, III, IV, V로 하여 분석법의 전 조작을 3회 수행하여 각각 직선식을 구하고, 각 직선식 결정계수(R2)로부터 직선성을 평가하였다. 정확성은 암브록솔염산염 표준품(99.97%) 15 mg을 정밀히 취하여 0.1 mol/l 메탄올성염산시액에 녹여 정확하게 100 ml로 한 것을 표준원액(150.0 mg/ml)으로 하고, 시럽은 시험약 A 10 ml를 0.1 mol/l 메탄올성염산시액에 녹여 정확하게 200 ml로 한 것을 제제 희석액으로 하고, 정제는 시험약F 1정을 0.1 mol/l 메탄올성염산시액에 녹여 정확하게 200 ml로 한 것을 제제 희석액으로 하였다. 표준원액 및 제제 희석액을 취하여 0.
- 정확성은 클렌부테롤염산염 표준품(100.0%) 10 mg을 정밀히 취하여 이 동상에 녹여 정확하게 100 ml로 하고, 이 액 1ml를 취하여 이동상에 녹여 정확하게 100 ml로 한 것을 표준원액(1.0 μg/ml)으로 하고, 시험약 C 자체를 제제원액으로 하였다.
- 직선성은 암브록솔염산염 표준품(99.97%)을 0.1 mol/l 메탄올성염산시액에 녹여 각각 약 1.5, 9.0, 12.0, 15.0, 18.0 μg/ml 해당액을 표준액 I, II, III, IV, V로 하여 분석법의 전 조작을 3회 수행하여 각각 직선식을 구하고, 각 직선식 결정계수(R2)로부터 직선성을 평가하였다.
- 직선성은 클렌부테롤염산염 표준품(100.0%)을 이동상에 녹여 각각 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 μg/ml 해당액을 표준액 I, II, III, IV, V로 하여 분석법의 전 조작을 3회 수행하여 각각 직선식을 구하고, 각 직선식 결정계수(R2)로부터 직선성을 평가하였다.
- 직선성은 클렌부테롤염산염 표준품(100.0%)을 이동상에 녹여 각각약 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 μg/ml 해당액을 표준액 I, II, III, IV, V 로 하여 분석법의 전 조작을 3회 수행하여 각각 직선식을 구하고, 각 직선식 결정계수(R2)로부터 직선성을 평가하였다.
- 클렌부테롤염산염 시럽 − 특이성은 표준액 및 희석용매를 검액으로 하여 이들의 크로마토그램 및 포토다이오드어레이(PDA)를 이용하여 첨가제에 의한 주성분 피크의 간섭여부를 확인하였다.
- 클렌부테롤염산염 시럽 − 함량 분석법의 밸리데이션 결과 포토다이오드어레이(PDA)를 이용하여 주성분 피크의 단일성 여부를 확인하였다(Fig. 6).
- 클렌부테롤염산염 정 − 특이성은 표준액 및 희석용매를 검액으로 하여 이들의 크로마토그램 및 포토다이오드어레이(PDA)를 이용하여 첨가제에 의한 주성분 피크의 간섭여부를 확인하였다.
- 클렌부테롤염산염 정 − 함량 분석법의 밸리데이션 결과 포토다이오드어레이(PDA)를 이용하여 주성분 피크의 단일성 여부를 확인하였다(Fig. 8).
- 표준원액 및 제제 원액을 취하여 이동상을 넣어 만든 각각 약 0.45, 0.50, 0.55 μg/ ml 해당액을 정확성 시험용액으로 하여 각 농도의 정확성시험용액 I, II, III 용액에 대해서 분석법의 전 조작을 각 농도당 3회씩 반복 측정한 결과로부터 회수율(%)을 계산하여 정확성을 평가하였다.
- 표준원액 및 제제 희석액을 취하여 0.1 mol/l 메탄올성염산시액을 넣어 만든 각각 약 13.5, 15.0, 16.5 μg/ml 해당액을 정확성 시험용액으로 하여 각 농도의 정확성시험용액 I, II, III 용액에 대해서 분석법의 전 조작을 각 농도당 3회씩 반복 측정한 결과로부터 회수율(%)을 계산하여 정확성을 평가하였다.
- 표준원액 및 제제 희석액을 취하여 이 동상을 넣어 만든 각각 약 0.9, 1.0, 1.1 μg/ml 해당액을 정확성 시험용액으로 하여 각 농도의 정확성시험용액 I, II, III 용액에 대해서 분석법의 전 조작을 각 농도당 3회씩 반복 측정한 결과로부터 회수율(%)을 계산하여 정확성을 평가하였다.
대상 데이터
- 4) 암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 복합성분 정제로 선정하였다.
- 「대한민국약전외 의약품 기준」에 수재된 암브록솔염산염과 클렌부테롤염산염 제제 함량 시험법 중 단순 희석 후 흡광도를 측정하는 정량법으로 설정된 암브록솔염산염 단일성분 정제를 제외하고, 추출, 분획분리 및 농축 등 복잡한 전처리 과정을 포함하는 1) 암브록솔염산염 단일성분 시럽제, 2) 클렌부테롤염산염 단일성분 시럽제, 3) 암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 복합성분 시럽제, 4) 암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 복합성분 정제로 선정하였다. 실험에 사용된 시험약은 국내 허가현황을 검토하여 서로 다른 제조회사이면서 현재 유통되는 제품으로 선정하였다(Table I).1,13)
- 암브록솔염산염 표준품(Fluka, A9797, USA) 및 클렌부테롤염산염 표준품(Sigma, C5423, USA)을 구입하여 사용하였다. 고성능 액체크로마토그래프(HPLC) 이동상 제조에 사용한 아세토니트릴 및 메탄올 등의 시약은 Merck사(Darmstadt, Germany)의 HPLC 등급을 사용하였다.
데이터처리
- 기울기 S는 분석대상물질의 검량선으로부터 구하였으며, 표준편차 σ는 검량선 y절편의 표준편차를 이용하였다.
이론/모형
- 0 μg/ml)을 가지고 분석법의 전 조작을 6회 반복 측정한 결과로부터 상대표준편차(%)를 계산하여 정밀성을 평가하였다. 정량한계는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법에 따라 구하였다.
성능/효과
- 2,14) 분석하고자 하는 성분의 분리 및 정량에 최적화된 기기분석 조건을 찾아내어 상대적으로 적은 양의 희석용매로 실험 할 수 있게 됨에 따라 기존 시험법에서 추출을 위해 소모되는 유기용매와 산의 양을 현저히 감소시켰다. 이는 실험법 개선을 통해 환경과 실험실내 유해한 요소를 경감하는 효과를 가져온 것으로 판단된다.
- 6%로 각 제형 별 설정된 기준규격에 적합하였다. 또한 기존 KPC 시험법의 시험결과와 비교하여 t검정을 통한 유의성 검정을 한 결과 두 시험법간의 결과의 차이가 없음과 동 분석법을 적용하기에 타당함을 확인하였다.
- 암브록솔염산염은 1.5~18.0 μg/ml의 범위에서 결정계수(R2) 0.999 이상을 나타내었고(Fig. 5), 정확성은 암브록솔염산염의 경우 정확성시험용액 I, II, III 용액(각각 13.5, 15.0, 16.5 μg/ml)을 가지고 분석법 전 조작을 각 농도 3회씩 반복 측정한 결과 평균 회수율 100.8%, 표준편차 0.830%의 결과를 나타내었다(Table II).
- 정밀성은 정밀성 시험용액을 가지고 분석법의 전 조작을 6회 반복 측정한 결과로부터 구한 상대표준편차는 0.68%였으며(Table III), 정량한계는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법에 따라 측정하였을 때 0.204 μg/ ml로 나타났다.
- 정밀성은 정밀성 시험용액을 가지고 분석법의 전 조작을 6회 반복 측정한 결과로부터 구한 상대표준편차는 0.77%의 결과를 나타내었고(Table V), 정량한계는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법에 따라 측정하였을 때 정량한계는 0.021 μg/ml로 나타났다.
- 정밀성은 정밀성 시험용액을 가지고 분석법의 전 조작을 6회 반복 측정한 결과로부터 구한 상대표준편차는 0.92%의 결과를 나타내었고(Table VII), 정량한계는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법에 따라 측정하였을 때 정량한계는 0.073 μg/ml로 나타났다.
- 3(a) 방법으로 암브록솔염산염 함량시험 한 결과를 Table VIII에 나타내었다. 주성분의 표시량에 대한 함량 백분율은 각각 101.7%, 101.3%, 101.7%, 98.7%, 99.5%, 99.6%로 각 제형 별 설정된 기준규격에 적합하였다. 또한 기존 KPC 시험법의 시험결과와 비교하여 t검정을 통한 유의성 검정을 한 결과 두 시험법간의 결과의 차이가 없음과 동 분석법을 적용하기에 타당함을 확인하였다.
- 3(b) 방법으로 클렌부테롤염산염 함량시험 한 결과를 Table IX에 나타내었다. 주성분의 표시량에 대한 함량 백분율은 각각 99.7%, 93.6%, 97.9%, 95.1%, 94.8%로 각 제형 별 설정된 기준규격에 적합함에 따라 동 분석법을 적용하기에 타당함을 확인하였다. 동일 검체를 가지고 기존 시험법으로 반복 시험한 결과 내 편차가 커 새로운 시험법과 기존 시험법간 유의성 검정이 불가하였다.
- 클렌부테롤염산염은 정확성 시험용액 I, II, III (각각 0.45, 0.50, 0.55 μg/ml)을 가지고 분석법 전 조작을 각 농도 3회씩 반복 측정한 결과 평균 회수율 99.8%, 표준편차 0.877% 결과를 나타내었다(Table IV).
- 클렌부테롤염산염은 정확성 시험용액 I, II, III(각각 0.90, 1.00, 1.10 μg/ml)을 가지고 분석법 전 조작을 각 농도 3회씩 반복 측정한 결과 평균 회수율 100.0%, 표준편차 0.893%의 결과를 나타내었다(Table VI).
후속연구
- 또한 추출법을 희석법으로 변경한 새로운 시험법은 시간과 비용이 개선되었고, 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 정량한계를 확인하고 국내유통 의약품 중에서 시험약을 선정하여 기존 시험법과 비교분석 후 확립된 시험법 및 규격을 적용해 보았다. 이는 신속하고 재현성 있는 시험법의 설정으로 의약품의 품질관리 수준을 향상시킬 수 있으며, 본 연구에서 제안하는 시험규격은 식품의약품안전처고시「대한민국약전외 의약품 기준」개정 시 기초자료로 활용 가능하며, 국내 유통의약품의 생산·유통과정에 있어서 일정한 품질이 확보된 제품을 지속적으로 공급하는데 기여할 것으로 기대된다.
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